DE69928395T2 - Cyclin-e2 proteine und dafür kodierende gene - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft im allgemeinen neue Gene kodierend Proteine, welche Mitglied der Zellzyklusprotein-Familie, bekannt als "Cycline" sind. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein neues Protein mit der Bezeichnung Cyclin E2, DNA kodierend Cyclin E2 und Verfahren zum Herstellen und Verwenden der Cyclin E2 Gene und Polypeptide.
  • Hintergrund
  • Verwandter Stand der Technik
  • A. CDK-Cyclin-Komplexe
  • Zellteilung ist ein komplexer Prozess, welcher durch eine Vielzahl von zellulären und Umweltfaktoren reguliert wird. Jüngste Untersuchungen haben zwei Klassen von Proteinen identifiziert, welche scheinbar Schlüsselrollen bei der Steuerung des Zell-Zyklus spielen. Diese Klassen schließen die Cyclin-abhängigen Proteinkinasen ("Cdks") und die Cycline ein. Cdks fungieren durch Phosphorylieren ausgewählter Proteinsubstrate in der Zelle; diese phosphorylierten Proteine wiederum "signalisieren" der Zelle, entweder den Prozess der Zellteilung einzuleiten oder fortzuführen. Damit Cdks aktiv werden können, d.h. andere Proteine phosphorylieren können, müssen sie an ein Cyclin-Protein gebunden sein. Folglich regulieren Cycline die Aktivität von Cdks durch Binden an diese.
  • Verschiedene Cdks und Cycline wurden identifiziert in Säugetieren. Derzeit sind 9 Cdks bekannt und sie werden bezeichnet als "Cdk1 ", "Cdk2" und so weiter. Zehn Familien von Cyclinen sind derzeit bekannt und werden als "Cyclin A", "Cyclin B" usw. bis zu "Cyclin J" bezeichnet. Für einen allgemeinen Überblick über die Cycline siehe Coats et al. in Signal Transduction, Heldin und Purton, eds., Chapman und Hall, veröffentlicht 1996; Seiten 347–360 und Lees (Curr. Opinions Cell Biol., 7: 773–780 (1995)).
  • Jede Cyclin-Familie kann mehr als ein Mitglied aufweisen. Säugetiere beispielsweise haben zwei Typen von Cyclin A, Cyclin A1, und Cyclin A2, und drei Typen von Cyclin D (D1, D2 und D3). Vor der vorliegenden Erfindung war nur ein Säugetier Cyclin E, Cyclin E1, bekannt, obwohl Pathway to Cancer, a Cold Spring Harbor Winter Conference, Harlow et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Seite 49 (1998) angeblich neues Cyclin E Protein identifiziert hatten. Keine DNA oder Aminosäuren-Sequenz-Daten mit Hinblick auf dieses Molekül sind verfügbar.
  • Cyclin-Familienmitglieder werden typischer Weise klassifiziert, basierend auf ihren Aminosäure-Sequenz-Homologien mit existierenden Familienmitgliedern. Beispielsweise weist Cyclin A2 ungefähr 45 Prozent Aminosäure-Sequenz-Homologie mit Cyclin A1 auf, jedoch nur ungefähr 19% Sequenz-Homologie mit Cyclin D1 und 21% Sequenz-Homologie mit Cyclin E1 (wie berechnet wird unter Verwendung des MacVector® Cluster Alignment Software Programm von Oxford Molecular Group).
  • Alle Cyclin-Moleküle enthalten eine Aminosäure-Sequenz-Domäne, welche als "Cyclin-Box" bezeichnet wird. Die Cyclin-Box ist ungefähr 100 Aminosäuren lang (die durchschnittliche Gesamtläge eines Cyclin-Polypeptids ist 300–500 Aminosäuren) und ist im mittleren Abschnitt eines jeden Cyclins lokalisiert. Während die präzise Aminosäure-Sequenz der Cyclin-Box von Familie zu Familie weiter geht und sogar innerhalb von Mitgliedern einer Familie, gibt es ein hochkonserviertes Motiv innerhalb der Cyclin-Box, welches konsistent in allen Cyclin-Boxen vorliegt (siehe Prosite Public Database, Zugangsnummer PS00292, welches eine Cyclin-Box "Consensus" Sequenz darstellt).
  • Cycline und Cdks binden aneinander in einer hochselektiven Art und Weise; nicht alle Cycline binden an alle Cdks. Beispielsweise kann Cyclin D1 mit Cdk4, jedoch nicht mit Cdk2 assoziieren. In ähnlicher Art und Weise kann Cyclin E mit Cdk2 und Cdk3 assoziieren, jedoch nicht mit Cdk4; Cyclin A kann mit Cdk2 assoziieren, jedoch nicht mit Cdk5. Die Ausbildung von Cyclin-Cdk-Komplexen ist transient; die beiden Moleküle können in der Zelle zur gleichen Zeit vorliegen, können aber nur einen aktiven Komplex ausbilden, falls Cdk durch ein Enzym mit der Bezeichnung "Cak" zur Cdk-aktivierenden Kinase phosphoryliert wird.
  • B. Cyclin E1
  • Menschliches Cyclin E1 wurde erstmals 1991 kloniert und wurde als bindend an und aktivierend für Cdk2 identifiziert (U.S. Patent Nr. 5,449,755, veröffentlicht am 12, Sept. 1995; WO 93/06123 veröffentlicht am 01. April 1993; Koff et al., Cell, 66: 1217–1228 (1991); siehe auch PCT-Anmeldung WO 98/03649, veröffentlicht 29. Jan. 1998). Cyclin E1-Homologe wurden identifiziert in Drosophila (Richardson et al., Development, 119: 673–690 (1993)), Maus (Damjanov et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 201: 994–1000 (1994), Xenopus (Chevalier et al., J. Cell Sci., 109: 1173–1184 (1996)) und Zebrafischen (Yarden et al., Devel. Dynam. 206: 1–11 (1996)). Darüber hinaus wurde von zwei Cyclin E1-Varianten berichtet. Die erste von diesen ist eine menschliche Cyclin E1-Splice-Variante (Mumberg et al., Nuc. Acids Res., 25: 2098–2105 (1997)), welche angeblich eine internale Deletion von 45 Aminosäuren aufweist und ein Expressionsmuster aufweist, welches unterschiedlich von Volllängen Cyclin E1 ist. Die andere berichtete Variante weist angeblich nicht die 15 Aminosäuren am Aminoterminus auf (Ohtsubo et al., Mol. Cell. Biol., 15: 2612–2624 (1995)).
  • Ein neues Cyclin-Polypeptid mit der Bezeichnung Cyclin N, welches angeblich verwandt mit Cyclin E1 ist, wurde jüngst in der Literatur beschrieben (Lauper et al., Abstracts from the 1998 Cold Spring Harbor Laboratory Cell Cycle Meeting, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998) S. 115).
  • C. Cycline und Krebs
  • Ein entscheidender Punkt an Krebs ist die unkontrollierte und anscheinend unregulierte Teilung von Zellen. Die Rolle von Cyclinen und Cdks in der Regulation der Zellteilung legt nahe, dass diese Proteine im Konvertierten von normalen Zellen zu krebsartigen Zellen involviert sein können. Verschiedene jüngste Untersuchungen haben sich folglich auf die Cyclin-und Cdk-Rolle in Krebs fokusiert. Beispielsweise zeigte Sherr in einem jüngsten Review-Artikel (Sciende, 274: 1672–1677 (1996)) auf, dass Überexpression von Cyclin D1 in Sarcomas, colorektalen Tumoren, und Melanoms zu sehen ist, und das Cyclin E in Brust-, Magen-, Darm-und endometrialen Carcinomen überextremiert wird.
  • Sarcevic et al., (J. Biol. Chem., 272: 33327–33337 (1997)) beschreibt die Substrat-Spezifitäten verschiedener Cyclin-Cdk-Komplexe in T-47D menschlichen Brustkrebs-Zellen. Sie haben beispielsweise herausgefunden, dass Cyclin D1-Cdk4 ein 38 kDa Protein phosphorylierte, wohingegen Cyclin D3-Cdk4 ein 105 kDa Protein, ein 102 kDa Protein und ein 42 kDa Protein phosphorylierte. Cyclin E1-Cdk2 und Cyclin A-Cdk2 phosphorylierte verschiedene Proteine.
  • Cyclin E1 war in Brustkrebs impliziert. In jungen Brustkrebspatientinnen korreliert eine hohe Cyclin E1 Expression in Brusttumorgeweben angeblich mit verminderter Überlebensrate (Porter et al., Nature Med., 3: 222–225 (1997)). Darüber hinaus wird Cyclin E1 offensichtlich in verschiedenen Brustkrebs-Zellen überextremiert (Gray-Bablin et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93: 15215–15220 (1996)).
  • Geht man davon aus, dass Cyclin-Cdk-Komplexe in die Zellteilung involviert sind und in Krebs-Zellen aktiv sind, könnte die Inaktivierung dieser Komplexe in einer verminderten Tumorzell-Proliferation resultieren. US Patent Nr. 5,645,999, veröffentlicht am 08. Juli 1997, beschreibt Assays, welche angeblich bedeutsam sind für die Indentifizierung von Verbindungen, welche die Cyclin E1-Aktivität modulieren.
  • Einige natürlich vorkommende Proteine wurden identifiziert als Inhibitoren der Cyclin-Cdk-Aktivität. Diese schließen die Proteine p21 und p27 (US Patent Nr. 5,688,665 veröffentlicht am 18. Nov. 1997; PCT WO96/02140, veröffentlicht am 01. Feb. 1996; Sherr et al., Genes and Devel., 9: 1149–1163 (1995)) ein. Das Protein p21 bindet angeblich an Cdk1, Cdk2 und Cdk4 und kann offensichtlich sowohl Cyclin D-Cdk-Komplexe als auch Cyclin E-Cdk-Komplexe inhibieren (Sherr et al., supra). Das Protein p27 bindet angeblich an Cyclin-Cdk-Komplexe (eher als an isolierte Cdks) und kann offensichtlich Cyclin A, B, D und E-abhängige Kinase-Aktivität inhibieren (Sherr et al., supra). Jedoch wurde Cyclin E1-Cdk2 auch als angeblich reguliert durch p27 identifiziert (Sheaff et al., Genes and Devel., 11: 1464–1478 (1997)).
  • Mit Hinblick auf die verheerenden Auswirkungen von Krebs besteht ein Bedürfnis auf dem Gebiet, Moleküle im menschlichen Körper zu identifizieren, welche möglicherweise eine bedeutsame Rolle in der Ethnologie dieser Erkrankung spielen, und die Expression solcher Moleküle in Patienten zu manipulieren, welche unter diesen und verwandten Krankheiten leiden.
  • Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Nukleinsäuren und Polypeptide zur Verfügung zu stellen, welche eine Rolle in der Zellteilung spielen.
  • Es ist des weiteren eine Aufgabe, Verfahren zum Verändern des Grades der Expression und/oder der Aktivität solche Peptide im menschlichen Körper zur Verfügung zu stellen.
  • Andere verwandte Aufgaben werden leicht beim Lesen dieser Offenbarung ersichtlich werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes biologisch aktives Cyclin E2-Nukleinsäure-Molekül zur Verfügung kodierend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
    • a) dem Nukleinsäure-Molekül umfassend SEQ ID NO. 1;
    • b) dem Nukleinsäure-Molekül umfassend SEQ ID NO. 2;
    • c) dem Nukleinsäure-Molekül umfassend SEQ ID NO. 5;
    • d) dem Nukleinsäure-Molekül umfassend SEQ ID NO. 7;
    • e) dem Nukleinsäure-Molekül umfassend SEQ ID NO. 8;
    • f) einem Nukleinsäure-Molekül kodierend das Polypeptid von SEQ ID NO. 3, oder ein biologisch aktives Fragment von besagtem Polypeptid;
    • g) einem Nukleinsäure-Molekül kodierend das Polypeptid von SEQ ID NO. 4, oder ein biologisch aktives Fragment von besagtem Polypeptid;
    • h) einem Nukleinsäure-Molekül kodierend das Polypeptid von SEQ ID NO. 6, oder ein biologisch aktives Fragment von besagtem Polypeptid;
    • i) einem Nukleinsäure-Molekül, welches ein Polypeptid kodiert, das zumindest 70% identisch ist mit dem Polypeptid kodiert durch SEQ ID NO. 1;
    • j) einem Nukleinsäure-Molekül, welches ein Polypeptid kodiert, das zumindest 70% identisch ist mit dem Polypeptid kodiert durch SEQ ID NO. 5;
    • k) einem Nukleinsäure-Molekül, welches ein Polypeptid kodiert, das zumindest 70% identisch ist mit dem Polypeptid kodiert durch SEQ ID NO. 2;
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Vektoren zur Verfügung, umfassend die Nukleinsäuren und Wirts-Zellen umfassend die Vektoren.
  • In einer noch anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Prozess zum Erzeugen eines Cyclin E2-Polypeptids zur Verfügung, umfassend die Schritte der Expression eines Polypeptid kodiert durch ein Cyclin E2-Nukleinsäure-Molekül in einer geeigneten Wirtszelle und des Isolierens des Polypeptids.
  • Noch in einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Cyclin E2-Polypeptid zur Verfügung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: dem Polypeptid von SEQ ID NO. 3, dem Polypeptid von SEQ ID NO. 4, dem Polypeptid von SEQ ID NO. 6 und einem Polypeptid, welches zumindest 70% identisch ist zu irgend einer der SEQ ID NOn, 3, 4 oder 5, wobei das Cyclin E2-Polypeptid ein Amino-terminales Methionin aufweisen kann oder nicht.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren zur Verstärkung der Proliferation einer Zelle zur Verfügung, umfassend die Expression einer Nukleinsäure kodierendend Cyclin E2 oder ein biologisch aktives Fragment davon, in der Zelle.
  • In einer noch anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren zur Verfügung, zum Erhöhen der Zellteilung einer Zelle umfassend die Expression eines Cyclin E2 Gens oder eines biologisch aktiven Fragments davon in der Zelle.
  • Die Erfindung stellt des weiteren ein in-vitro-Verfahren zum Verringern der Zellteilung in einer Zelle zur Verfügung, umfassend die Expression einer Cyclin E2-Mutante in einer Zelle, wobei die Mutante eine Cyclin E2-biologische Aktivität aufweist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 stellt die Volllängen-DNA-Sequenz von menschlichem Cyclin E2 (SEQ ID NO, 1) dar.
  • 2 stellt die Volllängen-DNA-Sequenz von Maus-Cyclin E2 (SEQ ID NO, 1) dar.
  • 3 stellt die putative Gesamtlängen-Aminosäuren-Sequenz (SEQ ID NO, 3) von menschlichem Cyclin E2, wie von der cDNA translatiert, zur Verfügung.
  • 4 stellt die putative Gesamtlängen-Aminosäuren-Sequenz (SEQ ID NO, 4) von Maus-Cyclin E2, wie von der cDNA translatiert, zur Verfügung.
  • 5 stellt die Volllängen-cDNA-Sequenz einer menschlichen Cyclin E2-Splice-Variante zur Verfügung (SEQ ID NO. 5).
  • 6 stellt die putative Gesamtlängen-Aminosäuren-Sequenz (SEQ ID NO. 6) von der menschlichen Cyclin E2-Splice Variante kodiert durch die DNA von SEQ ID NO. 5 dar.
  • 7 stellt die Sequenz eines RNA-Moleküls (SEQ ID NO. 7) kodierend das menschliche Volllängen-Cyclin E2 dar, in welchem die Kodons zur Expression in E. coli Zellen optimiert worden sind.
  • 8 stellt die Sequenz eines RNA-Moleküls (SEQ ID NO. 17) kodierend das Volllängen Maus-Cyclin E2 dar, in welchem die Kodons zur Expression in E. coli Zellen optimiert worden sind.
  • 9 ist eine Photografie eines mit Coomassie angefärbten SDS Gels. "Stds" bezeichnet vorgefärbte Molekular-Gewichts-Standard des angegebenen molekularen Gewichts und "Cyc E2" bezieht sich auf menschliches Cyclin E2-Polypeptid.
  • 10A–10E sind Photografien von Western Blots (10A–D) und von Autorad (10E). Menschliche Zellen wurden transfiziert mit verschiedenen DNA Konstrukten, wie unten an den Panels angegeben ist. "pEGFP" bezieht sich auf den GFP-Vektor; "HA-Cdk2" bezieht sich auf Hemaglutin-getaggtes Cdk2; "p27" bezieht sich auf einen Vektor enthaltend menschliche p27 cDNA; "GFP-E2" bezieht sich auf einen Vektor enthaltend GFP DNA fusioniert an Volllängen-Cyclin E2 cDNA und "GFP-E2sv" bezieht sich auf einen Vektor enthaltend GFP DNA fusioniert an menschliche Cyclin E2-Splice-Varianten cDNA. Für alle Panels wurden die transfizierten Zellen lysiert. In 10A–D wurden die Zell-Lysate mit Anti-GFP-Antiserum behandelt, wonach Protein A-Sephorose-Beats hinzugegeben wurden, um die Anti-GFP-Körper zu immunopräzipitieren. Die Immunpräzipitate wurden auf einem Gel laufen gelassen, auf einen Western Blot transferiert und mit den Antikörpern, angegeben auf der linken Seite eines jeden Panels, markiert. Für 10E wurden Histon H1 und 32P-ATP zum Zellextrakt hinzu gegeben, für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Mischung wurde dann auf SDS-PAGE laufen gelassen. Das Gel wurde dann einem Film für 2 Stunden exponiert. Die Identität einer jeden Bande auf den Western Blots und Autorad wird auf der rechten Seite eines jeden Panels angegeben.
  • 11 stellt eine "zweideutige Sequenz" von menschlichem Cyclin E2 dar (SEQ ID NO. 8); diese Sequenz identifiziert diejenigen Kodons, welche verändert werden können, zur optimalen Expression der Dann, sowohl in den eukaryotischen als auch in den prokaryotischen Wirtszellen. In dieser Figur haben die Buchstaben B, D, H, K, M, R, S, V, W, Y und N die üblichen IUPAC-Bedeutungen für Nukleotide.
  • 12 ist ein Balkengraph eines Northern Blots, welcher die mRNA-Expressions-Grade von menschlichem Cyclin E2, menschlichem Cyclin E1 und dem Enzym GADPH (als Kontrolle) quantifiziert und zwar in verschiedenen menschlichen Geweben. Die menschlichen Gewebe werden auf der X-Achse angegeben. Der Balkengraph wurde erzeugt durch einen Computerscan des Northern Blots nach Untersuchung mit jeder Sonde. Cyclin E1, Cyclin E2 und GADPH sind angegeben.
  • 13 ist ein Northern Blot von menschlichen Brusttumor-abgeleiteten Zelllinien untersucht mit Cyclin E1-und Cyclin E2-Sonden. "Normal" bezieht sich auf normal immortalisierte Zellen. Östrogen-Rezeptor-Positive ("ER+") und Östrogen-Rezeptor-Negative ("ER–") tumorabgeleitete Zelllinien werden angegeben. Der Name einer jeden Zelllinie wird oben an jedem Blot angegeben.
  • 14 stellt eine "zweideutige Sequenz" von Maus-Cyclin E2 (SEQ ID NO. 18) dar; diese Sequenz identifiziert diejenigen Kodons, welche zur optimalen Expression der DNA sowohl in eukaryotischen als auch prokaryotischen Wirtszellen verändert werden können. Die Buchstaben haben die üblichen IUPAC-Bedeutung für Nukleotide.
  • 15 stellt einen Western Blot (15A) und einen Kinase-Assay (15B) einer von menschlichen Osteosarkomen abgeleiteten Zelllinie mit der Bezeichnung Saos-2 dar. In 15A wurden die Zellen lysiert und immunopräzipitiert mit entweder prä-immunem ("PI"; Zeile 2) oder mit Anti-Cyclin E2-Antiserum ("E2"; Zeile 3). Die Immunopräzipitate wurden auf SDS-PAGE laufen gelassen, von welchem ein Western Blot erzeugt wurde. Der Blot wurde mit Anti-Cdk2-Antikörpern untersucht. In 15B wird der Extrakt von der gleichen Zelllinie präpariert und mit Anti-Cyclin E2-Antikörper behandelt (Zeilen 2–4) oder präimmunem Serum (Zeile 14); GST-Rb-Protein (Zeile 3) oder Histon-H1-Protein (Zeile 2) wurden dann hinzugegeben zum Immunopräzipitat. Nach 30 Minuten bei 37°C wurden die Immunopräzipitate auf SDS-PAGE laufen gelassen und einem Film für 2 Stunden exponiert.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Enthalten im Umfang der Erfindung sind Cyclin E2-Polypeptide, wie z.B. die Polypeptide von SEQ ID NO. 3 und SEQ ID NO. 4, und verwandte biologische Peptidfragmente, Varianten und Derivate davon. Diese Cyclin E2-Polypeptide weisen eine Homologie von ungefähr nur 47% mit Cyclin E1-Polypeptiden auf der Aminosäureebene und ungefähr 55% auf DNA-Ebene auf.
  • Enthalten innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäure-Moleküle, welche Cyclin E2-Polypeptide kodieren und Verfahren zum Herstellen der Polypeptide.
  • Auch enthalten innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind nichtmenschliche Säugetiere, z.B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen oder Schafe, in welchen das Gen (oder die Gene) kodierend natives Cyclin E2 zerstört ("ausgenockt") wurde (wurden), so dass der Grad der Expression dieses Gens (oder dieser Gene) signifikant vermindert oder vollständig heruntergefahren ist (sind). Solche Säugetiere können hergestellt werden unter Verwendung von Techniken und Verfahren wie z.B. beschrieben ist im US Patent Nr. 5,557,032. Die vorliegende Erfindung enthält des weiteren nicht-menschliche Säugetiere wie z.B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen oder Schafe, in welchen das Gen (oder die Gene) kodierend Cyclin E2 (entweder die native Form von Cyclin E2 für das Säugetier oder ein heterologes Cyclin E2-Gen (heterologe Gene)) durch das Tier über-exprimiert wird (werden), wodurch ein "transgenes" Säugetier entsteht. Solche transgene Säugetiere können hergestellt werden unter Verwendung wohlbekannter Verfahren wie z.B. beschrieben im US Patent Nr. 5,489,743 und PCT-Patentanmeldung Nr. WO 94/28122 veröffentlicht am 08. Dez. 1994. Die vorliegende Erfindung enthält des weiteren nicht-menschliche Säugetiere, in welchen der Cyclin E2-Promotor entweder aktiviert oder inaktiviert ist (unter Verwendung homologer rekombinanter Verfahren, wie unten beschrieben wird), um den Grad der Expression von nativem Cyclin E2 zu verändern.
  • Die Cyclin E2-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zu den Zellen hinzugegeben werden, um die Zellteilung zu verstärken. Alternativ kann die Cyclin E2-Polypeptid-Aktivität in einer Zelle inhibiert oder inaktiviert werden, um die Zellteilung bestimmter Zellen zu verringern oder zu stoppen.
  • Die Bezeichnung „Cyclin E2 Protein" oder "Cyclin E2 Polypeptid" wie hier verwendet bezieht sich auf irgendein Protein oder Polypeptid mit den Eigenschaften, die hier für Cyclin E2 beschrieben werden. Die kleinen Buchstaben vor der Bezeichnung "Cyclin E2", wenn sie verwendet werden, beziehen sich auf ein Cyclin E2-Polypeptid eines speziellen Säugetiers, d.h. "h-Cyclin E2" bezieht sich auf menschliches Cyclin E2 und "m-Cyclin E2" bezieht sich auf Maus-Cyclin E2. Der Cyclin E2-Polypeptid kann ein Aminoterminales Methionin aufweisen oder nicht, abhängend von der Art und Weise, in welcher es hergestellt wird. Zum Zwecke der Illustration bezieht sich Cyclin E2-Protein oder Cyclin E2-Polypeptid auf
    • (1) ein biologisch aktives Polypeptid kodiert durch Cyclin E2 Nukleinsäure-Moleküle wie in irgend einem der Abschnitte (a)–(f) unten definiert und auf biologisch aktive Peptid oder Polypeptid-Fragmente davon;
    • (2) natürlich vorkommende Allel-Varianten und synthetische Varianten des Cyclin E2-Gens, welche ein Cyclin E2-Polypeptid kodieren, das eine oder mehrere Aminosäuren-Substitutionen, -Deletion und/oder -Insertionen im Vergleich zum Cyclin E2-Polypeptid von SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 4 aufweist und/oder
    • (3) biologisch aktive Polypeptide oder Fragmente oder Varianten davon, welche chemisch modifiziert wurden.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Cyclin E2-Fragment" auf ein Peptid oder Polypeptid, welches weniger als die Volllängen-Aminosäure-Sequenz von natürlich vorkommendem Cyclin E2-Protein darstellt, jedoch Cyclin E2 biologische Aktivität aufweist. Solch ein Fragment kann am Aminosäureende trunkiert sein, am Carboxy-Ende und/oder internal (wie z.B. durch natürliches Splicen) und kann eine Variante oder ein Derivat von Cyclin E2 darstellen. Solche Cyclin E2-Fragmente können hergestellt mit oder ohne Amino-terminales Methionin. Darüber hinaus können Cyclin E2-Fragmente natürlich vorkommende Fragmente wie z.B. die Cyclin E2-Splice-Variante (SEQ ID NO. 5), andere Splice-Varianten und Fragmente resultierend von der in vivo Protease-Aktivität sein.
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff "Cyclin E2-Variante" auf ein Cyclin E2-Polypeptid dessen Aminosäure-Sequenz eine oder mehrere Aminosäure-Sequenz-Substitution, – Deletion und/oder – Insertion im Vergleich zur Cyclin E2-Aminosäure-Sequenz dargestellt in SEQ ID NO. 3 und 4 enthält. Solche Cyclin E2-Varianten können hergestellt werden von den korrespondierenden Cyclin E2-Nukleinsäure-Molekül-Varianten, welche eine DNA-Sequenz aufweisen, welche entsprechend von den DNA- Sequenzen vom Wildtyp-Cyclin E2 wie in Sequenzen SEQ ID NO. 1 und 2 dargestellt abweicht.
  • Bevorzugte Varianten des menschlichen Cyclin E2-Polypeptids schließen Alanin-Substitutionen an einer oder mehreren der Aminosäure-Positionen 12–23, 32–53, 350–357 und 395–404 ein, welche dazu dienen können, die Substrat-Spezifität für Cyclin E2-Polypeptid zu verändern. Andere bevorzugte Varianten schließen Alanin-Substitutionen an den Aminosäure-Positionen 392, 396, 397, und/oder 401 ein, wobei diese Mutanten dazu dienen können, die Stabilität des Polypeptids zu verbessern.
  • Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff "Cyclin E2-Derivat" auf ein Cyclin E2-Polypeptid, Protein oder Fragment, welches chemisch modifiziert worden ist, beispielsweise durch Addition von einem oder mehreren Polyethylenglykol-Molekülen, Zuckern, Phosphaten und/oder anderen solchen Molekülen, wobei das Molekül oder die Moleküle nicht natürlich an Wildtyp-Cyclin E2-Polypeptide angeheftet ist/sind.
  • Wie hier verwendet beziehen sich die Begriffe " biologisch aktives Cyclin E2-Polypeptid", "biologisch aktives Cyclin E2-Fragment", "biologisch aktive Cyclin E2-Variante" und "biologisch aktives Cyclin E2-Derivat" auf ein Cyclin E2-Polypeptid, welches natürlich einen Komplex ausbildet, mit Cyclin-abhängiger Kinase 2 ("Cdk2") und in der Lage ist, das Retinoblastom ("Rb")-Genprodukt zu phosphorylieren.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Cyclin E2", wenn er verwendet wird, um ein Nukleinsäure-Molekül zu beschreiben, auf ein Nukleinsäure-Molekül oder Fragment davon, welches (a) die Nukleinsäure-Sequenz in SEQ ID NO. 1, oder SEQ ID NO. 2 aufweist; (b) eine Nukleinsäure-Sequenz kodierend das Polypeptid, welches zumindest 70% identisch mit dem Polypeptid kodiert durch irgend eine der SEQ ID NO. 1 oder 2 ist, aber auch mehr als 70% identisch sein kann, d.h. 75, 80, 85, 90, 95% oder sogar mehr als 95% identisch; (c) eine natürlich vorkommende Allel-Variante von (a) oder (b) ist; (d) eine Nukleinsäure-Variante von (a) bis (c) erzeugt, wie hier zur Verfügung gestellt, ist; und/oder (e) eine Sequenz aufweist, welche komplementär zu (a) bis (d) ist;
    Die Prozent-Sequenz-Identität kann bestimmt werden durch Standard-Verfahren, welche im allgemeinen verwandt werden, um die Ähnlichkeit hinsichtlich der Position der Aminosäure von zwei Polypeptiden zu vergleichen. Beispielsweise werden unter Verwendung eines Computer-Algorithmus wie z.B. BLAST, BLAST2 oder FASTA die bei den Polypeptide, für welche die prozentuale Sequenz-Identität bestimmt werden soll, zum optimalen Abgleich ihrer entsprechenden Aminosäuren aligned (in dem "passenden Abschnitt", welcher die volle Länge von einer von beiden Sequenzen enthalten kann, oder einen vorbestimmten Teil von einer von beiden Sequenzen). Jedes Computer-Programm stellt eine "default"-Öffnungs-Strafe und eine "default"-Gap-Strafe bereit, sowie eine Scoring-Matrix wie z.B. PAM 250 (für FASTA) oder BLOSUM 62 (für BLAST Algorithmen). Ein bevorzugter Algorithmus ist BLAST2.
  • Eine Standard Scoring-Matrix (siehe Dayhoff et al., in: Atlas of Protein Sequence and Structure, Band 5, Abschn. 3 (1978)) kann im Zusammenhang mit dem Computer-Algorithmus verwendet werden. Die prozentuale Identität kann dann berechnet werden durch Bestimmen der prozentualen Identität unter Verwendung eines Algorithmus enthaltend in einem Programm wie z.B. FASTA:
  • Figure 00120001
  • Polypeptide, welche zumindest 70% identisch sind, werden typischerweise eine oder mehrere Aminosäure-Substitution, -Deletion, und/oder -Insertion im Vergleich mit dem Wildtyp-Cyclin E2 aufweisen. Übleicherweise werden die Substitution des nativen Restes entweder Alanin oder eine konservierte Aminosäure sein, damit nur ein kleiner oder kein Effekt auf die Gesamtnetto-Ladung, die Polarität und die Hydrophobizität des Proteins ausgeübt wird. Konzervative Substitutionen sind in der Tabelle 1 unten dargestellt.
  • Tabelle 1
    Figure 00130001
  • Die Bezeichnungen "Bedingungen hohe Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierung und das Waschen unter Bedingungen, welche das Binden eines Nukleinsäure-Moleküls verwendet zum Screenen erlauben, z.B. einer Oligonukleotid-Sonde oder einer cDNA-Molekül-Sonde, an hoch homologe Sequenzen. Eine exemplarisch hoch stringende Waschlösung ist 0,2 × SSC und 0,1% SDS, verwendet bei einer Temperatur von zwischen 50°C–65°C.
  • Wo Oliogonukleotid-Sequenzen verwendet werden, um cDNA-oder genomische Bibliotheken zu screenen, kann eine der folgenden zwei hoch stringenden Lösungen verwendet werden. Die erste dieser ist 6 × SSC mit 0,05% Natriumpyrophosphat bei einer Tem peratur von 35°C–62°C, abhängig von der Länge der Oligonukleotid-Sonde. Beispielsweise werden 14 Basen-Paar-Sonden bei 35–40°C gewaschen, 17 Basen-Paar-Sonden bei 45–50°C gewaschen, 20 Basen-Paar-Sonden bei 52–57°C gewaschen und 23 Basen-Paar-Sonden bei 57–63°C gewaschen. Die Temperatur kann 2–3°C erhöht werden, wo das nicht-spezifische Hintergrund-Binden hoch erscheint. Eine zweite hochstringende Lösung setzt Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) zum Waschen von Oligonukleotid-Sonden ein. Eine stringende Waschlösung ist 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 0,2% SDS. Die Waschtemperatur unter Verwendung dieser Lösung ist eine Funktion der Länge der Sonde. Beispielsweise wird eine 17 Basen-Paar-Sonde bei ungefähr 45–50°C gewaschen.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich die Bezeichnung "effektive Menge" und "therapeutisch effektive Menge" auf die Menge an Cyclin E2, notwendig, um eine oder mehrere biologische Aktivitäten von Cyclin E2 wie oben dargestellt zu unterstützen.
  • Ein Cyclin E2-Polypeptid in Gesamtlänge oder ein Fragment davon kann unter Verwendung wohl bekannter rekombinanter DNA-Technologie-Verfahren hergestellt werden, wie z.B. denjenigen, die in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]) und/oder Ausubel et al., eds. (Current protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. und Wiley and Sons, NY [1994]) dargelegt sind. Ein Gen oder eine cDNA kodierend für das Cyclin E2-Protein oder Fragment davon kann z.B. durch Screening einer genomischen oder cDNA-Bibliothek oder durch PCR-Amplifikation erhalten werden.
  • Sonden oder Primer einsetzbar zum Screenen der Bibliothek können erzeugt werden, basierend auf Sequenz-Information für andere bekannte Gene oder Genfragmente von der gleichen oder einer verwandten Familie von Genen wie z.B. von konservierten Motiven welche sich in andere Cyclin-Genen befinden, wie z.B. die Cyclin-Box. Darüber hinaus, kann dort, wo ein Cyclin-Gen identifiziert wurde, von einer Spezies, die Gesamtheit oder ein Teil des Gens als eine Sonde verwendet werden, um homologe Gene von anderen Spezies zu identifizieren. Die Sonden oder Primer können verwendet werden, um cDNA Bibliotheken von verschiedenen Gewebsquellen zu screenen, von denen angenommen wird, dass sie das Cyclin E2-Gen exprimieren. Typischerweise werden Bedingungen hohe Stringenz eingesetzt zum Screenen, um die Anzahl der falsch positiven erhalten vom Screen zu minimieren.
  • Ein weiteres Mittel, um ein Gen herzustellen kodierend Cyclin E2-Polypeptid oder ein Fragment davon ist, ist es, chemische Synthese einzusetzen, unter Verwendung von dem Fachmann wohlbekannten Verfahren wie z.B. diejenigen beschrieben von Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716–734 [1989]). Diese Verfahren beinhalten u.a. die Phosphotriester-, Phosphoramidit-und N-Phosphonat-Verfahren zur Nukleinsäuresynthese. Ein bevorzugtes Verfahren für eine solche chemische Synthese ist die Polymergestützte Synthese, welche Standardphosphoramidit-Chemie verwendet. Typischerweise wird die DNA, welche das Cyclin E2-Polypeptid kodiert, mehrere 100 Nukleotide lang sein. Nukleinsäuren, welche größer als ungefähr 100 Nukleotide sind, können als mehrere Fragmente unter Verwendung dieses Verfahrens synthetisiert werden. Die Fragmente können dann miteinander ligiert werden, um das Gesamtlängen-Cyclin E2-Polypeptid zu bilden. Üblicherweise wird das DNA-Fragment kodierend für das Aminoende des Polypeptids ein ATG aufweisen, welches einen Methionin-Rest kodiert. Dieses Methionin kann in der reifen Form des Cyclin E2-Polypeptids gegenwärtig sein oder auch nicht, je nachdem, ob das Polypeptid, welches in der Wirtszelle produziert wurde, von dieser Zelle abgesondert wird.
  • In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Nukleinsäure-und/oder Aminosäurevarianten natürlich vorkommenden Cyclin E2 herzustellen. Nukleinsäurevarianten (in denen ein oder mehrere Nukleotide entworfen werden, um sich vom Wildtyp natürlich vorkommenden Cyclin E2 zu unterscheiden) können unter Verwendung von site-directed-Mutagenese oder PCR-Amplifikation hergestellt werden, wo der/die Primer die gewünschte Punktmutationen aufweisen (siehe Sambrook et al., supra, und Ausubel et al., supra, für Beschreibungen der Mutagenese Techniken). Chemische Synthese unter der Verwendung von Verfahren, beschrieben von Engels et al., supra, können auch durch zur Herstellung solcher Varianten verwendet werden. Andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können ebenso verwendet werden. Bevorzugte Nukleinsäurevarianten sind solche, welche Nukleotid-Substitutionen enthalten, welche die Kodonpräferenz in der Wirtszelle begründen, welche zur Herstellung von Cyclin E2 verwendet wird. Andere bevorzugte Varianten sind solche, welche für konservative Aminosäure-Änderungen, wie oben beschrieben, im Vergleich zum Wildtyp kodieren (wie z.B. worin Ladung oder Polarität der natürlich vorkommenden Aminosäuren-Seitenkette nicht substanziell durch Substitution mit einer unterschiedlichen Aminosäure verändert ist) und/oder solche, welche designed wurden, um entweder (eine) neue Glykosylierungs- und/oder (eine) Phosphorylierungs-Stelle(n) in Cyclin E2 zu generieren, oder solche, welche designed wurden, um (eine) exisitierende Glykosylierungs-und/oder Phosphorylierungs-Stelle(n) in Cyclin E2 zu deletieren.
  • Das Cyclin E2-Gen, die Cyclin E2-cDNA oder Fragmente davon können in einen geeigneten Expressionsvektor zur Expression in einer Wirtszelle insertiert werden. Der Vektor ist so gewählt, dass er in einer bestimmten Wirtszelle funktionell eingesetzt wird (d.h. der Vektor ist kompatibel mit dem Mechanismus der Wirtszelle, so dass Amplifikation des Cyclin E2-Gens und/oder Expression des Gens eintreten kann). Das Cyclin E2Gen, die cDNA oder ein Fragment davon kann in einer prokaryontischen, Hefe-, Insekten-(Baculovirus-Systeme) und/oder eukaryontischen Wirtszelle amplifiziert oder exprimiert werden. Die Selektion der Wirtszelle wird zumindest entscheidend davon abhängen, ob das Cyclin E2-Polypeptid oder Fragment davon glykosyliert sein soll. Wenn ja, sind Hefe-, Insekten-oder Säugetier-Zellen bevorzugt.
  • Typischerweise werden diese Vektoren, welche in einer der Wirtszellen verwendet werden, 5'-flankierende Sequenzen (bezeichnet als „Promotor") und ebenso andere regulatorische Elemente enthalten, wie z.B. (einen) Enhancer, einen Ursprung eines Replikationselements, ein transkriptionales Terminationselement, eine vollständige Intron-Sequenz beinhaltend eine Donor-und Akzeptorsplice-Stelle, eine Signalpeptid-Sequenz, ein Ribosom bindendes Site-Element, eine Polyadenylierungs-Sequenz, eine Polylinker-Region zur Insertierung der Nukleinsäure, welche das zu exprimierende Polypeptid kodiert, und ein wählbares Markerelement. Jedes dieser Elemente wird unten erläutert. Optional kann der Vektor eine "Tag"-Sequenz, d.h. eine Oligonukleotid-Sequenz lokalisiert am 5'-oder 3'-Ende der für Cyclin E2 kodierenden Sequenz, welche PolyHis kodiert (wie z.B. HexaHis), enthalten oder eine andere „Tag"-Sequenz, wie z.B. FLAG, HA (Hämoglutinin-Influenza-Virus). Dieses Tag wird zusammen mit dem Protein exprimiert und kann als Affinitätsmarkierung zur Reinigung des Cyclin E2-Polypeptids aus der Wirtszelle dienen. Die Affinität-Aufreinigung kann realisiert werden, beispielsweise durch Säulen -Chromatographie durch Verwenden von Antikörpern gegen das Tag als eine Affinität-Matrix. Optional kann das Tag nachfolgend entfernt werden von dem aufgereinigten Cyclin E2-Polypeptid mit Hilfe verschiedener Mittel, wie z.B. unter Verwendung verschiednener Peptidasen.
  • Die 5'-flankierende Sequenz kann homolog sein (d.h. von derselben Spezies und/oder demselben Stamm wie die Wirtszelle), heterolog (d.h., von einer Spezies verschieden von der Wirtszellen-Spezies oder dem Wirtszellen-Stamm), ein Hybrid (d.h. eine Kom bination von 5'-flankierenden Sequenzen aus mehr als einer Quelle), synthetisch oder sie kann die natürliche Cyclin E2-5'-flankierende Sequenz sein. Als solche kann die Quelle der 5'-flankierenden Sequenz ein unizellulärer prokaryontischer oder eukaryontischer Organismus sein, ein Wirbeltier-oder Nicht-Wirbeltierorganismus, eine Pflanze, vorausgesetzt, dass die 5'-flankierende Sequenz darin funktioniert, und kann durch die Mechanistik der Wirtszelle aktiviert werden.
  • Die 5'-flankierende Sequenz für den Gebrauch in den Vektoren der vorliegenden Erfindung kann durch eine der etlichen Verfahren, welche im Stand der Technik hinlänglich bekannt sind, erhalten werden. Typischerweise werden hierbei brauchbare 5'-flankierende Sequenzen, welche verschieden von der Cyclin E2-5'-flankierenden Sequenz sind, zuvor durch Kartierung und/oder durch Restriktionsendonuklease-Verdauung identifiziert worden sein und können daher von der geeigneten Gewebequelle unter Verwendung von geeigneten Restriktionsendonukleasen isoliert werden. In einigen Fällen kann die gesamte Nukleotid-Sequenz der 5'-flankierenden Sequenz bekannt sein. Hier kann die 5'-flankierende Sequenz unter der Verwendung der oben beschriebenen Verfahren zur Nukleinsäuresynthese oder zum Klonen synthetisiert werden.
  • Wo alle oder nur ein Abschnitt der 5'-flankierenden Sequenz bekannt sind, kann sie unter der Verwendung von PCR und/oder durch Screenen einer genomischen Bibliothek mit geeigneten Oligonukleotiden und/oder 5'-flankierenden Sequenzfragmenten derselben oder einer anderen Art erhalten werden.
  • Wo die 5'-flankierende Sequenz nicht bekannt ist, kann ein DNA-Fragment enthaltend eine 5'-flankierende Sequenz aus einem größeren Stück DNA isoliert werden, das z.B. eine kodierende Sequenz oder sogar ein anderes Gen oder andere Gene enthalten kann. Die Isolierung kann durch Verdauen mit Restriktionsendonuclease abgeschlossen werden, wobei ein oder mehrere sorgsam ausgewählte Enzyme) verwendet wird (werden), um das richtige DNA-Fragment zu isolieren. Nach Verdauung kann das gewünschte Fragment durch Agarosegel-Aufreinigung, Qiagen®Säule oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren isoliert werden. Die Wahl geeigneter Enzyme zum Erreichen dieses Ziels wird einem gewöhnlichen Fachmann sofort offensichtlich sein.
  • Die Replikations-Elemente stammen ursprünglich typischerweise von einem Teil von prokaryontischen Expressions-Vektoren, welche kommerziell erworben werden, und Hilfsmitteln zur Amplifikation des Vektors in der Wirtszelle. Die Amplifikation des Vektors in einer bestimmten Kopienzahl kann in einigen Fällen für die optimale Expression des Cyclin E2-Polypeptids wichtig sein. Falls der Vektor der Wahl keinen Ursprung für eine Replikations-Stelle beinhaltet, kann eine solche chemische Stelle basierend auf einer bekannten Sequenz synthetisiert werden und in einen Vektor ligiert werden.
  • Das Transkriptionsterminations-Element ist typischerweise lokalisiert am 3'-Ende der Cyclin E2-Polypeptid-kodierten Sequenz und dient zur Terminierung der Transkription des Cyclin E2-Polypeptids. Üblicherweise ist das Transkriptionsterminations-Element in prokaryontischen Zellen ein G-C-reiches Fragment, auf welches eine Poly-T-Sequenz folgt. Obwohl das Element leicht aus einer Bibliothek geklont oder sogar als Teil eines Vektors kommerziell gekauft wird, kann es auch leicht unter Verwendung von Verfahren für die Nukleinsäuresynthese, z.B. die oben beschriebenen, synthetisiert werden.
  • Ein selektives Markergen-Element kodiert ein Protein, welches für das Überleben und Wachstums einer Wirtszelle in einem ausgewählten Nährmedium notwendig ist. Typische Selektionsmarkergene kodieren Proteine, welche (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, wie z.B. Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin, für prokaryontische Wirtszellen vermitteln, (b) auxotrophe Mängel der Zelle kompensieren; oder (c) kritische Nährstoffe bereitstellen, welche nicht in komplexen Medien verfügbar sind. Bevorzugte wählbare Marker sind das Kanamycin-Resistenzgen, das Ampicillin-Resistenzgen und das Tetracyclin-Resistenzgen.
  • Das Ribosom-bindende Element, allgemein Shine-Dalgarno-Sequenz (Prokaryonten) oder Kozak-Sequenz (Eukaryonten) genannt, ist notwendig zur Initiation der Translation von mRNA. Das Element wird typischerweise 3' vom Promotor und 5' zur kodierenden Sequenz des Cyclin E2-Polypeptids, welches synthetisiert werden soll, lokalisiert. Die Shine-Dalgarno-Sequenz variiert, ist aber typischerweise ein Polypurin (d.h. hat einen hohen A-G-Anteil). Viele Shine-Dalgamo-Sequenzen sind identifiziert worden, wobei jede davon einfach unter der Verwendung von Verfahren, wie oben dargelegt, synthetisiert und in prokaryontischen Vektoren werden kann.
  • In den Fällen, wo es wünschenswert ist, dass Cyclin E2 von der Wirtszelle sekretiert wird, kann eine Signal-Sequenz verwendet werden, um das Cyclin E2-Polypeptid aus der Wirtszelle, in der es synthetisiert wird, herauszuleiten, und der Carboxy-endständige Teil des Proteins kann deletiert werden, um Membranverankerung zu verhindern. Typischerweise ist die Signal-Sequenz in der kodierenden Region der Cyclin E2- Nukleinsäure-Sequenz positioniert oder direkt am 5'-Ende der für Cyclin E2 kodierenden Region. Viele Signal-Sequenzen sind identifiziert worden und jede davon, welche in der ausgewählten Wirtszelle funktionell ist, kann in Verbindung mit dem Cyclin E2-Gen verwendet werden. Im diesem Zusammenhang kann die Signal-Sequenz homolog oder heterolog zum Cyclin E2-Gen sein und kann homolog oder heterolog zu dem Cyclin E2-Gen sein. Darüber hinaus kann die Signal-Sequenz chemisch unter Verwendung von Verfahren, wie oben dargestellt, synthetisiert werden.
  • In den meisten Fällen wird die Sekrektion des Polypeptids aus der Wirtszelle über die Präsenz eines Signalpeptids in der Entfernung des Amino-endständigen Methionins vom Polypeptid resultieren.
  • In vielen Fällen wird die Transkription des Cyclin E2-Gens durch die Gegenwart von einem oder mehreren Introns auf dem Vektor vergrößert; dies trifft besonders für eukaryontische Wirtszellen zu, speziell für Säugetier-Wirtszellen. Die verwendeten Introns können natürlich vorkommenende sein, innerhalb des Cyclin E2-Gens, speziell wo das Cyclin E2-Gen, welches verwendet wird, eine Volllängen genomische Sequenz oder ein Fragment davon ist. Wo das Intron nicht natürlicherweise innerhalb der Cyclin E2-DNA-Sequenz (wie bei den meisten cDNAs) vorkommt, können das/die Introns) aus einer anderen Quelle erhalten werden. Die Position des Introns im Verhältnis zu der 5'-flankierenden Sequenz und der für Cyclin E2 kodierenden Sequenz ist wichtig, da das Intron transkribiert werden muss, um effektiv zu sein. Wo die Cyclin E2-Nukleinsäure-Sequenz eine cDNA-Sequenz ist, ist die bevorzugte Position als solche für das Intron 3' zur Transkriptionsstart-Stelle und 5' zu der Poly-A-Transkriptions-Terminations-Sequenz. Bevorzugt für Cyclin E2-cDNAs wird das Intron auf der einen oder anderen Seite (d.h. 3' oder 5' zu) der Cyclin E2-kodierenden Sequenz so lokalisiert sein, dass es nicht diese kodierenden Sequenz unterbricht. Jedes Intron aus jeder Quelle, einschließlich jedes viralen, prokaryontischen oder eukaryontischen (Pflanze oder Tier) Organismus kann verwendet werden, um diese Erfindung zu praktizieren, vorausgesetzt, dass es kompatibel mit der/den Wirtszelle(n) ist, in welche es insertiert ist. Ebenfalls eingeschlossen hierbei sind synthetische Introns. Optional kann mehr als ein Intron in dem Vektor verwendet werden.
  • Wo ein oder mehrere der Elemente, wie oben dargestellt, noch nicht im Vektor, welcher verwendet werden soll, vorhanden sind, können diese individuell erhalten und in den Vektor legiert werden. Verfahren, welche zum Erhalt eines jeden dieser Elemente ver wendet werden, sind dem Fachmann wohl bekannt und sind vergleichbar zu den Verfahren, wie oben dargestellt (d.h. Synthese der DNA, Bibliotheken-Screening, usw.).
  • Die letztendlichen Vektoren, welche zum Ausführen dieser Erfindung verwendet werden, sind typischerweise konstruiert aus einem Ausgangsvektor, z.B. einem kommerziell verfügbaren Vektor. Solche Vektoren können einige der Elemente enthalten, welche in dem fertigen Vektor enthalten sein sollen oder auch nicht. Wenn keines der gewünschten Elemente im Ausgangsvektor enthalten ist, kann jedes Element individuell in den Vektor durch Schneiden des Vektors mit geeigneter (geeigneten) Restriktionsendonuclease(n) ligiert werden, so dass die Enden des hineinzuligierenden Elements und die Enden des Vektors kompatibel für die Ligation sind. In manchen Fällen kann es nötig sein, die aneinander zu ligierenden Enden „abzustumpfen", um eine zufriedenstellende Ligation zu erhalten. Das Abstumpfen wird durch ein erstes Einfüllen von "klebrigen Enden" unter der Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase oder T4-DNA-Polymerase in der Gegenwart von allen vier Nukleotiden bewerkstelligt. Dieses Verfahren ist im Stand der Technik wohl bekannt, wie z.B. in Sambrook et al., supra.
  • Alternativ können zwei oder mehr der in den Vektor zu insertierenden Elemente zuerst aneinander ligiert werden (wenn sie nebeneinander in Position gebracht werden sollen), dann in den Vektor ligiert werden.
  • Ein anderes Verfahren zur Konstruktion des Vektors ist es, alle Ligationen der verschiedenen Elemente gleichzeitig in einer Reaktionsmischung durchzuführen. Damit werden viele unsinnige und nicht funktionelle Vektoren durch unsachgemäße Ligation oder Insertion von Elementen erzeugt, jedoch können die funktionellen Vektoren identifiziert werden und durch Verdauen mit Restriktionsendonuklease ausgewählt werden.
  • Bevorzugte Vektoren zur Durchführung dieser Erfindung sind solche, welche kompatibel mit bakteriellen, von Insekten und Säugetieren stammenden Wirtszellen sind. Solche Vektoren schließen u.a. pCRII (Invitrogen Company, San Diego, CA), pBSII (Stratagene Company, LaJolla, CA) pET15b (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BIueBacII; Invitrogen) und pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY).
  • Nachdem der Vektor konstruiert worden ist und ein Nukleinsäure-Molekül kodierend Volllängen-oder trunkiertes Cyclin E2 an der geeigneten Stelle in den Vektor insertiert worden ist, kann der fertige Vektor in eine geeignete Wirtszelle zur Amplifikation und/oder Cyclin E2-Polypeptid-Expression eingesetzt werden.
  • Wirtszellen können prokaryontische Wirtszellen sein (wie z.B. E. coli) oder eukaryontische Wirtszellen (wie z.B. eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Wirbeltierzelle). Die Wirtszelle kann, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, Cyclin E2-Protein synthetisieren, welches in der Folge aus dem Kulturmedium (wenn die Wirtszelle es in das Medium sekretiert) oder direkt aus der es produzierenden Wirtszelle (wenn es nicht sekretiert wird) gesammelt werden kann. Nach Sammeln kann das Cyclin E2-Protein unter Verwendung von Verfahren wie z.B. Molekularsieb-Chromatografie, Affinitäts-Chromatografie und dergleichen gereinigt werden.
  • Die Wahl der Wirtszelle wird teilweise davon abhängen, je nachdem, ob das Cyclin E2-Protein glykosyliert werden soll oder phosphoryliert werden soll (in diesem Fall sind eukaryontische Wirtszellen bevorzugt), und von der Art und Weise, in welcher die Wirtszelle in der Lage ist, das Protein in eine native Tertiärstruktur (z.B. richtige Orientierung der Disulfidbrücken etc.) "zu falten", so dass das biologisch aktive Protein in der Zelle hergestellt wird. Wo jedoch die Wirtszelle kein Cyclin E2-Polypeptid, welches biologische Aktivität zeigt, synthetisiert, kann das Cyclin E2 nach der Synthese unter der Verwendung geeigneter chemischer Bedingungen, wie unten diskutiert, "gefaltet werden".
  • Geeignete Zellen oder Zelllinien können Säugetier-Zellen, wie z.B. Chinesische Hamster-Eierstockzellen (CHO) oder 3T3-Zellen, sein. Die Auswahl geeigneter Säugetierzellen und Verfahren zur Transformation, Kultivierung, Amplifikation, Screenen und Produktherstellung und Reinigung sind im Stand der Technik bekannt. Andere geeignete Säugetier-Zelllinienen sind die Affen-Zelllinien COS-1 und COS-7 und die CV-1-Zelllinie. Weitere exemplarische Säugetier-Zellen schließen Primaten-Zelllinien und Nagetierzelllinien, einschließlich transformierte Zelllinien, ein. Normale diploide Zelllinien, abgeleitet von in vitro Kulturen von primärem Gewebe, als auch von primären Explantaten, sind ebenso geeignet. Kanditaten-Zellen können in dem Selektionsgen genotypisch unzulänglich sein oder können ein dominant agierendes Selektionsgen beinhalten. Andere geeignete Säugetier-Zelllinien schließen HeLa-Zellen, Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien, abgeleitet aus Swiss-, Balb-c-oder NIH-Mäusen, BHK-oder HaK-Hamsterzelllinien ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Ähnlich nützlich wie Wirtszellen geeignet für die vorliegende Erfindung sind Bakterienzellen. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z.B. HB101, DH5α, DH10 und MC1061) als Wirtszellen im Feld der Biotechnologie wohl bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas spp., andere Bacillus spp., Streptomyces spp. und dergleichen können auch für dieses Verfahren eingesetzt werden.
  • Viele Stämme von Hefezellen, welche dem Fachmann bekannt sind, sind auch als Wirtszellen für die Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung verfügbar. Desweiteren können bei Bedarf Insektenzellen-Systeme im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Solche Systeme werden beispielsweise beschrieben in Kitts et al. (Biotechniques, 14: 810–817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564–572 [1993]) und Lucklow et al. (J. Virol., 67: 4566–4579 [1993]). Bevorzugte Insektenzellen sind Sf-9 und Hi5 (Invitrogen, Carlsbac, CA).
  • Insertion (auch gekennzeichnet als "Transformation" oder "Transfektion") des Vektors in die ausgewählte Wirtszelle kann unter der Verwendung solcher Verfahren wie Kalziumchlorid, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion oder des DEAE-Dextran-Verfahrens vollendet werden. Das gewählte Verfahren wird teilweise eine Funktion des Typs der Wirtszelle, welche verwendet wird, sein. Diese Verfahren oder andere geeigneten Verfahren sind dem Fachmann wohl bekannt und sind z.B. in Sambrook et al., supra, dargestellt.
  • Die Wirtszellen, welche den Vektor (d.h. transformiert oder transfektiert) enthalten, können unter Verwendung von Standardmedien, welche dem Fachmann wohl bekannt sind, kultiviert werden. Diese Medien werden üblicherweise alle Nährstoffe enthalten, welche notwendig für das Wachstum und Überleben dieser Zellen sind. Geeignete Medien zur Kultivierung von E. coli-Zellen sind z.B. Luria Broth (LB) und/oder Terrific Broth (TB). Geeignete Medien zur Kultivierung von Eukaryonten-Zellen sind RPMI 1640, MEM, DMEM, von denen alle um Serum und/oder Wachstumsfaktoren ergänzt werden können, wie es von besonderen Zelllinien zur Kultivierung benötigt wird. Ein geeignetes Medium der Insekten-Kulturen ist das Grace-Medium, ergänzt um Yeastolat, Lactalbuminhydrolysat und/oder je nach Bedarf fötales Kälberserum.
  • Typischerweise wird ein Antibiotikum oder ein anderer Wirkstoff geeignet für das selektive Wachstum transformierter Zellen nur als Ergänzung zum Medium hinzugefügt. Der Wirkstoff, welcher verwendet werden soll, wird diktiert durch das selektierbare Markerelement, welches in dem Plasmid vorhanden ist, mit welchem die Wirtszelle transformiert wurde. Wo das wählbare Markerelement beispielsweise Kanamycin-Resistenz ist, wird der Wirkstoff, welcher zum Kultivierungsmedium hinzugefügt wird, Kanamycin sein.
  • Die Menge von Cyclin E2-Polypeptid, welches in der Wirtszelle produziert wird, kann unter Verwendung von Standardverfahren, welche im Stand der Technik wohl bekannt sind, ausgewertet werden. Solche Verfahren schließen ohne Einschränkung Western-Blot-Analyse, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, nicht-denaturierende Gelelektrophorese, HPLC-Separation, Immunopräzipitation und/oder Aktivitäts-Assays, wie DNA-bindende Gelshift-Assays, ein.
  • Wenn das Cyclin E2-Polypeptid so designed wurde, dass es von der Wirtszelle sekretiert wird, wird Polypeptid zum größten Teil wahrscheinlich im Zellkultur-Medium zu finden sein. Polypeptide, welche auf diese Weise hergestellt werden, werden typischerweise kein Amino-endständiges Methionin besitzen, da dieses bei der Sekretion aus der Zelle entfernt wird. Wenn jedoch Cyclin E2-Polypeptid nicht aus der Wirtszelle sekretiert wird, wird es im Zytoplasma vorliegen (für eukaryontische grampositive Bakterien-und Insektenwirtszellen) oder im Periplasma (für gramnegative Bakterienwirtszellen) und kann ein Amino-endständiges Methionin haben.
  • Für das Cyclin E2-Polypeptid situiert im Wirtszell-Cytoplasma und/oder Kern werden die Wirtszellen üblicherweise zuerst mechanisch oder osmotisch zerstört, um den Inhalt des Zytoplasmas in eine gepufferte Lösung freizusetzen. Cyclin E2-Polypeptid kann dann aus dieser Lösung isoliert werden.
  • Die Reinigung von Cyclin E2-Polypeptid aus der Lösung kann unter der Verwendung einer Reihe von Techniken vollendet werden. Wenn das Polypeptid so synthetisiert worden ist, dass es ein Tag beinhaltet, z.B. Hexahistidin (Cyclin E2/HexaHis) oder andere kleine Peptide wie z.B. FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) oder myc (Invitrogen, Carlsbad, CA) an entweder seinem Carboxyl oder Amino-Terminus, kann es notwendigerweise in einem einstufigen Prozess durch Passieren der Lösung durch eine Affinitätssäule gereinigt werden, wobei die Säulenmatrix eine hohe Affinität für das Tag oder für das Polypeptid direkt (d.h. ein monoklonaler Antikörper, welcher spezifisch Cyclin E2 erkennt) aufweist. Zum Beispiel bindet Polyhistidin mit großer Affinität und spezifisch an Nickel, und deshalb kann eine Affinitätssäule aus Nickel (wie z.B. Qiagen®-Nickelsäulen) zur Reinigung von Cyclin E2/PolyHis verwendet werden. (Siehe z.B.
  • Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, Section 10. 11. 8, John Wiley & Sons, New York [1993]).
  • Wo das Cyclin E2-Polypeptid ohne ein angeheftetes Tag hergestellt wird, und keine Antikörper verfügbar sind, können andere wohl bekannte Verfahren zur Aufreinigung genutzt werden. Solche Verfahren schließen ohne Einschränkung Ionenaustauscher-Chromatographie, Molekularsieb-Chromatografie, HPLC, native Gelelektrophorese in Kombination mit Geleluierung und präparative elektrische Fokussierung ("Isoprime"-Maschine/Technik, Hoefer Scientific) mit ein. In einigen Fällen können zwei oder mehrere dieser Techniken kombiniert werden, um einen höheren Reinheitsgrad zu erreichen.
  • Falls es vorweggenommen wird, dass das Cyclin E2-Polypeptid in erster Linie intrazellulär zu finden ist, kann das intrazelluläre Material (einschließend Inclusions-Körperchen für gramm-negative Bakterien) von der Wirtszelle extrahiert werden unter Verwendung von Standardtechniken, welche dem Fachmann kannt sind. Zum Beispiel kann die Wirtszelle lysiert werden, um die Inhalte des Periplasmas durch Französische Presse, Homogenisation und/oder Auflösen in Ultraschallbad freizusetzen. Das Homogenat kann dann zentrifugiert werden.
  • Wenn das Cyclin E2-Polypeptid Einschlusskörper im Periplasma gebildet hat, können die Einschlusskörper oft an innere und/oder äußere zelluläre Membranen binden und werden daher in erster Linie nach der Zentrifugation im Niederschlag gefunden werden. Das Niederschlagsmaterial kann dann mit einem chaotropen Agens, wie z.B. Guanidin oder Harnstoff behandelt werden, um Einschlusskörper freizusetzen, aufzubrechen und in Lösung zu bringen. Das Cyclin E2-Polypeptid in seiner jetzt löslichen Form kann dann unter Verwendung von Gel-Elektrophorese, Immunopräzipitation oder dergleichen analysiert werden. Wenn es gewünscht ist, das Cyclin E2-Polypeptid zu isolieren, kann die Isolation unter der Verwendung von Standardverfahren bewerkstelligt werden, wie z.B. diejenigen, die weiter unten und in Marston et al. (Meth. Enz., 182: 264–275 [1990]) dargestellt sind.
  • Wenn Cyclin E2-Polypeptid-Einschlusskörper nicht in einem signifikanten Ausmaß im Periplasma der Wirtszelle gebildet werden, wird das Cyclin E2-Polypeptid in erster Linie nach der Zentrifugation des Zellhomogenats im Überstand zu finden sein und das Cyclin E2-Polypeptid kann aus dem Überstand unter der Verwendung von Verfahren, wie unten dargestellt, isoliert werden.
  • In denjenigen Situationen, wo es bevorzugt ist, das Cyclin E2-Polypeptid partiell oder komplett zu isolieren, kann die Aufreinigung unter Verwendung von Standardverfahren, welche dem Fachmann wohl bekannt sind, vervollständigt werden. Solche Verfahren schließen ohne Einschränkung Trennung durch Elektrophorese, gefolgt von Elektroeluierung, verschiedene Typen von Chromatografie (Immunoaffinität, Molekularsieb und/oder Ionenaustauscher) und/oder Hochdruckflüssigkeits-Chromatografie ein. In einigen Fällen kann es bevorzugt sein, mehr als eines dieser Verfahren zur vollständigen Aufreinigung zu verwenden.
  • Zusätzlich zur Herstellung und zur Reinigung von Cyclin E2-Polypeptid unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken können Cyclin E2-Polypeptidfragmente und/oder Derivate davon durch chemische Synthese-Verfahren (wie z.B. Festphasen-Peptidsynthese) unter der Verwendung von Vektoren, welche im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden wie diejenigen, die von Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 [1964]), Houghten et al. (Proc Natl Acad. Sci. USA, 82: 5132 [1985]) und Stewart und Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem Co., Rockford, IL [1984]) dargestellt wurden. Solche Polypeptide können mit oder ohne Aminoendständiges Methionin synthetisiert werden. Chemisch synthetisierte Cyclin E2-Polypeptide oder Fragmente können unter Verwendung von Verfahren, wie in diesen Verweisen dargestellt, oxidiert werden, um Disulfidbrücken zu bilden. Man erwartet, dass die Cyclin E2-Polypeptide oder Fragmente biologische Aktivität vergleichbar zu Cyclin E2-Polypeptiden erzeugt, rekombinant oder aufgereinigt von natürlichen Quellen, aufweisen und folglich austauschbar mit rekombinanten oder natürlich vorkommenden Cyclin E2-Polypeptiden verwendet werden können.
  • Chemisch modifizierte Cyclin E2-Verbindungen (d.h. "Derivate"), in denen das Cyclin E2-Polypeptid mit einem Polymer verknüpft ist ("Cyclin E2-Polymere"), sind im Umfang der vorliegenden Erfindung miteingeschlossen. Das gewählte Polymer ist typischerweise wasserlöslich, so dass das Protein in wässriger Umgebung, wie in einer physiologischen Umgebung, nicht ausfällt. Das gewählte Polymer ist üblicherweise modifiziert, so dass es eine einzelne reaktive Gruppe hat, wie z.B. eine aktive Estergruppe zur Acylierung oder ein Aldehyd zur Alkylierung, so dass der Grad der Polymerisation, wie er in den vorliegenden Verfahren bereitgestellt wird, kontrolliert werden kann. Das Polymer kann von irgendeinem Molekulargewicht sein und kann verzweigt oder unverzweigt sein. Eingeschlossen im Umfang der Cyclin E2-Polymere ist eine Mischung aus Polymeren. Bevor zugt für die therapeutische Verwendung der Endprodukt-Präparation wird das Polymer pharmazeutisch akzeptabel sein.
  • Das wasserlösliche Polymer oder eine Mischung davon kann aus der Gruppe bestehend aus z.B. Polyethylenglykol (PEG), Monomethoxy-polyethylenglykol, Dextran, Cellulose oder anderen kohlenhydratbasierten Polymeren, Poly-(N-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Propylenglykolhomopolymeren, einem Polypropylenoxid/Ethylenoxidcopolymer, polyoxyethylierten Polyolen (z.B. Glycerol) und Polyvinylalkohol ausgewählt werden.
  • Für die Acetylierungsreaktionen sollte das/die Polymer(e), das/die ausgewählt wird/werden, eine einzelne reaktive Estergruppe aufweisen. Zur reduktiven Alkylierung sollten das/die Polymer(e), das/die ausgewählt wird/werden, eine einzelne reaktive Aldehydgruppe aufweisen. Ein bevorzugtes reaktives Aldehyd ist Polyethylenglycol-Propionaldehyd, welcher wasserstabil ist oder C1-C10-Alkoxy oder Aryloxy-Derivate davon (siehe US Patent Nr. 5,252,714).
  • Pegylierung von Cyclin E2 kann durch jegliche der im Stand der Technik bekannten Pegylierungs-Reaktionen durchgeführt werden, wie z.B. in den folgenden Verweisen beschrieben: Focus on Growth Factors 3: 4–10 (1992); EP 0 154 316 ; und EP 0 401 384 . Vorzugsweise wird die Pegylierung über eine Acylierungsreaktion oder eine Alkylierungsreaktion mit einem reaktiven Polyethylenglykolmolekül (oder einem analog reaktiven wasserlöslichen Polymer), wie unten beschrieben, durchgeführt.
  • Ein besonders bevorzugtes wasserlösliches Polymer für die Verwendung hierin ist Polyethylenglykol, abgekürzt PEG. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff Polyethylenglykol alle Formen von PEG ein, welche für die Derivatisierung von anderen Proteinen verwendet wurden, wie Mono-(C1-C10)alkoxy-oder -aryloxy-polyethylenglykol.
  • Generell kann chemische Derivatisierung unter jeglichen geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, welche zur Reaktion einer biologisch aktiven Substanz mit einem aktivierten Polymermolekül verwendet werden. Verfahren zur Herstellung pegylierten Cyclin E2 werden generell folgende Schritte umfassen: (a) Reaktion des Cyclin E2-Polypeptids mit Polyethylenglykol (wie einem reaktiven Ester oder Aldehydderivat von PEG) unter Bedingungen, in denen Cyclin E2 an ein oder mehrere PEG-Gruppen gebunden wird und (b) Erhalten der oder des Endprodukts (e). Generell werden die optimalen Versuchsbedingungen für die Acetylierungs-Reaktionen basierend auf bekannten Parametern und dem erwünschten Resultat bestimmt. So ergibt z.B. ein größeres Mengenverhältnis von PEG:Protein eine größere prozentuale Ausbeute des polypegylierten Produkts.
  • Allgemein schließen Zustände, welche durch die Gabe des vorliegenden Polymer/Cyclin E2 gelindert oder moduliert werden können, solche ein, welche hier für Cyclin E2-Moleküle im Allgemeinen beschrieben werden. Jedoch können die Polymer/Cyclin E2-Moleküle, welche hierin offenbart werden, zusätzliche Aktivitäten haben, im Vergleich zu den nicht derivatisierten Molekülen, verstärkte oder reduzierte Aktivitäten, oder andere Eigenschaften, wie z.B. erhöhte oder verminderte Halbwertszeit im Vergleich zu den nicht derivatisierten Molekülen.
  • Die Cyclin E2-Polypeptide, Fragmente davon, Varianten und Derivate können eingesetzt werden allein, zusammen oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen. Die Cyclin E2 Polypeptide Fragmente, Varianten oder Derivate können verwendet werden in Kombination mit Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Anti-Inflammatorien und/oder chemotherapeutischen Agenzien, wie dies für die Indikation, die zu behandeln gilt, geeignet ist.
  • Die Cyclin E2 Moleküle, egal ob allein oder in einer Kombinations-Therapie verabreicht, können bedeutsam für das Vorantreiben der Zell-Teilung von speziellen Zell-Populationen wie z.B. weißem Blutzellen, roten Blutzellen, Neuronen, Chondrocyten und dergleichen sein. In AIDS-Patienten und Krebs-Patienten, welche einer Chemotherapie unterzogen worden sind und/oder einer Knochenmark-Transplantation wird die Zahl der weißen Blutkörperchen typischerweise niedrig sein; die Verabreichung von Cyclin E2 für Patienten-Stammzellen und/oder weiße Blutzellen, entweder durch Gentherapie oder direkte Behandlung der Zellen mit Cyclin E2 in einer ex vivo Art und Weise könnte dazu dienen, die weißen Blutkörperchen-Anzahl zu vergrößern. In ähnlicher Art und Weise könnte in Hämophilie-und Dialyse-Patienten beispielsweise die Behandlung von Progenitor-Erythroblast-Zell-Populationen von Patienten mit Cyclin E2 über Gentherapie oder ein ex vivo-Behandlung die Zahl der roten Blutzellen erhöht werden. Eine weitere Indikation, in welcher die Cyclin E2-Verabreichung bedeutsam sein könnte, ist es, Chondrocyten in Patienten zu erhöhen, welche unter der Degeneration von Knorpeln leiden, auf Grund von Gelenk-Verletzungen, Arthritis oder dergleichen leiden. Hier kann Cyclin E2 entweder über Gentherapie den Chondrocyten zugeführt werden oder durch ex vivo-Behandlung von kultivierten Chondrocyten verabreicht werden. Noch eine ande re Anwendung für die Cyclin E2-Therapie wäre es, Populationen von Neuronen in Patienten, welche unter Alzheimer Krankheit oder anderen Neurologischen Erkrankungen leiden, welche von Apoptose verschiedener Neuronen herrühren, zu expandieren. Schließlich könnte die Cyclin E2-Therapie in Schlaganfällen oder Ischämie angezeigt sein, in welchen Gewebsschäden vom Verlust des Blutflusses herrühren. Hier könnte die Verabreichung von Cyclin E2 an Zellen welche das Gebiet der Nekrose umgeben, dazu dienen, das nekrotische Gewebe zu regenerieren.
  • Cyclin E2-Nukleinsäure-Moleküle, Fragmente und/oder Derivate, welche nicht selbst Polypeptide, welche in Aktivitäts-Assays aktiv sind, kodieren, können als Hybridisierungssonden in diagnostischen Assays verwendet werden, um entweder qualitativ oder quantitativ auf die Gegenwart von Cyclin E2-DNA oder RNA in Säugetiergeweben oder Körperflüssigkeits-Proben zu testen.
  • Cyclin E2-Polypeptid Fragmente, Varianten und/oder Derivate welche selbst nicht aktiv in Aktivitäts-Assays sind, können bedeutsam für die Herstellung von Antikörpern sein, welche Cyclin E2-Polypeptide erkennen.
  • Die Cyclin E2-Polypeptide und/oder Fragmente davon können zur Herstellung von Antikörpern, die durch Standardmethoden erzeugt werden, verwendet werden. Folglich werden Antikörper, welche mit den Cyclin E2-Polypeptiden reagieren, als auch reaktive Fragmente solcher Antikörper als ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen betrachtet. Die Antikörper können polyklonal, monoklonal, rekombinant, chimär, einkettig und/oder bispezifisch sein. Typischerweise können die Antikörper oder Fragmente davon "humanisiert" werden, d.h. so präpariert werden, dass eine Immunreaktion von Antikörpern, wenn er dem Patienten verabreicht wird, vermieden oder miniert wird. Das Antikörperfragment kann jedes Fragment sein, welches reaktiv mit dem Cyclin E2 der vorliegenden Erfindung ist, wie z.B. Fab, Fab', etc. Ebenfalls von dieser Erfindung bereitgestellt werden die Hybridome, welche durch Präsentieren von Cyclin E2 oder einem Fragment davon als Antigen für ein ausgewähltes Säugetier, gefolgt von Fusionierung von Zellen (z.B. Milzzellen) des Tieres mit bestimmten Krebszellen erzeugt werden, um immortalisierte Zelllinien durch bekannte Techniken zu erhalten. Die Verfahren, welche zum Erhalt solcher Zelllinien und Antikörper, welche gegen ganze oder Teile des menschlichen Cyclin E2-Polypeptid der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, eingesetzt werden, sind ebenfalls von dieser Erfindung umfasst.
  • Die Antikörper können therapeutisch eingesetzt werden, wie z.B. zur Inhibition des Binden von Cyclin E2 an Cdks. Die Antikörper können des Weiteren in vivo und in vitro für diagnostische Zwecke verwendet werden, z.B. in gelabelter Form, um die Gegenwart von Cyclin E2 in Blutflüssigkeit oder Zellproben nachzuweisen.
  • Bevorzugte Antikörper sind menschliche Antikörper, entweder polyclonale oder monoclonale.
  • Therapeutische Zusammensetzungen und Verabreichung
  • Therapeutische Zusammensetzungen zur Behandlung verschiedener Erkrankungen des neurologischen Systems liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Solche Zusammensetzungen können eine therapeutisch effektive Menge von Cyclin E2-Polypeptid oder eines Fragments, einer Variante oder eines Derivats in Beimischung mit einem pharmazeutisch aufnehmbaren Träger umfassen. Das Trägermaterial kann für Injektionen Wasser, bevorzugt ergänzt mit weiteren Substanzen, welche üblich für die Administration für Säugetiere sind, sein. Typischerweise wird ein therapeutischer Cyclin E2-Wirkstoff in Form einer Verbindung, welche das gereinigte Protein (welches chemisch modifiziert sein kann) in Verbindung mit einem oder mehreren physiologisch akzeptablen Trägern, Bindemitteln oder Verdünnungsmitteln verabreicht. Neutral puffernde Salze oder Salze gemischt mit Serumalbumin sind beispielsweise geeignete Träger. Bevorzugt wird das Produkt als ein Lyophilisat unter Verwendung geeigneter Bindemittel (z.B. Sucrose) formuliert. Andere Standardträger, Verdünnungsmittel und Bindemittel können wie gewünscht enthalten sein. Andere exemplarische Verbindungen umfassen Tris-Puffer mit etwa pH 7.0–8.5 oder Acetat-Puffer von etwa pH 4.0–5.5, welche des weiteren Sorbitol oder ein anderes geeignetes Substitut dafür enthalten können.
  • Die Cyclin E2-Zusammensetzungen können systemisch parenteral verabreicht werden. Alternativ können die Verbindungen intravenös oder subkutan verabreicht werden. Bei systemischer Verabreichung können die therapeutischen Verbindungen zur Verwendung im Rahmen dieser Erfindung in Form von pyrogenfreier, parenteral aufnehmbarer (akzeptabler) wässriger Lösung sein. Die Herstellung solcher pharmazeutisch aufnehmbarer Proteinlösungen unter angemessener Berücksichtigungen von pH, Isotonizität, Stabilität und dergleichen, ist Stand der Technik.
  • Die therapeutische Formulierung von Cyclin E2-Verbindungen, brauchbar für die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung, kann für Zwecke der Lagerung durch Vermischen der ausgewählten Verbindung, welche den gewünschten Reinheitsgrad aufweist, mit optional physiologisch aufnehmbaren Trägern, Bindemitteln oder Stabilisatoren (Remingtons Pharmacdutical Sciences, 18th Edition, A. R. Genaro, ed., Mack Publishing Company [1990]) in Form eines lyophilisierten Kuchens oder einer wässrigen Lösung hergestellt werden. Aufnehmbare Träger, Bindemittel oder Stabilisatoren sind nicht toxisch für den Empfänger und sind bei den angewandten Dosierungen und Konzentrationen bevorzugt inert und schließen Puffer, wie Phosphat, Citrat oder andere organische Säuren; Antioxidantien, wie Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide; Proteine, wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunoglobuline; hydrophile Polymere, wie Polyvinylpyrrolidone; Aminosäuren, wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glykose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie EDTA; Zuckeralkohole, wie Mannitol oder Sorbitol; salzbildenden Gegenione, wie Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG) ein.
  • Eine effektive Menge der Cyclin E2-Zusammensetzung(en), welche therapeutisch eingesetzt werden sollen, wird beispielsweise von den therapeutischen Aufgaben abhängen, wie z.B. der Indikation, für welche Cyclin E2 verwendet werden soll, die Art der Verabreichung und dem Zustand des Patienten. Dementsprechend wird es notwendig sein, für den Therapeuten die Dosis zu titern um die Art der Verabreichung zu modifizieren wie dies benötigt wird, um den optimalen therapeutischen Effekt zu erzielen. Eine typische tägliche Dosis kann von ungefähr 0,1 μg/kg bis hin zu 100 μg/kg oder mehr reichen, abhängig von den oben erwähnten Faktoren. Typischerweise wird ein Arzt die Cyclin E2-Zusammensetzung verabreichen, bis eine Dosis erreicht wird, welche den gewünschten Effekt erzielt. Die Cyclin E2-Zusammensetzung kann daher verabreicht werden als eine einzelne Dosis oder als zwei oder mehrere Dosen (welche die gleiche Menge an Cyclin E2 enthalten können oder nicht) über die Zeit oder als eine kontinuierliche Infusion über eine Implantations-Vorrichtung oder eine Katheter.
  • Mit der Durchführung weiterer Untersuchungen wird Information zu Tal gefördert, betreffend geeignete Dosiergrade zur Behandlung verschiedener Konditionen in verschiedenen Patienten und übliche Fachmann wird unter Berücksichtigung des therapeutischen Zusammenhangs, des Typs der Erkrankung welche behandelt wird, des Alters und des allgemeinen Gesundheitszustandes des Empfängers in der Lage sein, eine geeignete Dosierung sicherzustellen.
  • Die Cyclin E2-Verbindung, welche für in vivo Anwendung verwendet wird, muss steril sein. Dies erreicht man leicht durch Filtration durch sterile Filttrations-Membrane. Wo die Cyclin E2-Verbindung lyophylisiert ist, kann Sterilisation unter Verwenden dieser Verfahren entweder vor oder nach Lyophilisation oder Rekonstitution durchgeführt werden. Verbindung zur parenteralen Verabreichung werden üblicherweise in lyophylisierter Form oder in Lösung gelagert.
  • Therapeutische Verbindungen werden generell in einem Behälter gelagert, welcher eine sterile Zugangsöffnung hat, z.B. eine intravenöse Lösung in Beutel oder Phiole, welche einen Stöpsel haben, der durch eine Injektionsnadel durchstochen werden kann.
  • Der Weg der Verabreichung der Verbindung ist im Einklang mit bekannten Verfahren, z.B. oral, Injektion oder Infusion auf intravenösen, intraperitonealen, intrazerebralen (intraparenchymalen), intrazerebroventrikularen, intramuskulären, intraokularen, intraarteriellen oder intraläsionalen Wegen, oder durch fortwährende Abgabesysteme oder Implantationseinheit, welche optional die Verwendung eines Katheders mit einschließen können. Wo gewünscht können die Verbindungen kontinuierlich verabreicht werden durch Infusion, Bolusinjektion oder durch Implantationseinheit.
  • Alternativ oder additiv kann Cyclin E2 lokal verabreicht werden via Implantation in das betroffene Gebiet einer Membran, eines Schwamms oder eines anderen geeigneten Materials, auf welchen Cyclin E2-Polypeptid absorbiert wurde.
  • Wo eine Implantationseinheit verwendet wird, kann die Einheit in jegliches geeignetes Gewebe oder Organ implantiert werden und die Abgabe des Cyclin E2 kann direkt durch die Einheit via Bolus oder kontinuierliche Verabreichung oder über einen Katheder unter Verwendung einer kontinuierlichen Infusion erfolgen.
  • Cyclin E2-Polypeptid kann in einer fortwährend abgebenden Formulierung oder Präparation verabreicht werden. Geeignete Beispiele für fortwährend freisetzende Herstellungen schließen semipermeable Polymermatrizen in Form von geformten Artikeln, z.B. Filmen, oder Mikrokapseln ein. Kontinuierlich freisetzende Matrizen schließen Polyester, Hydrogele, Polylactide (US 3,773,919, EP 58,481), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gammaethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547–556 [1983]), Poly(2-hydroxyethyl-methacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167–277 [1981) und Langer, Chem. Tech., 12: 98–105 [1982], Ethylenvinylacetat (Langer et al., supra) oder Poly-D(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133,988 ) ein. Kontinuierlich freisetzende Verbindungen können auch Liposomen einschließen, welche durch eine der verschiedenen im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden können (z.B., Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688–3692 [1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949).
  • In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Cyclin E2-Verbindungen in einem ex vivo Verfahren, zu verwenden. Hier werden Zellen, Gewebe oder Organe Cyclin E2 Zusammensetzungen ausgesetzt, wonach die Zellen, Gewebe und/oder Organe anschließend zurück in den Patienten implantiert werden.
  • In anderen Fällen kann Cyclin E2 durch Implantierung bestimmter Zellen, welche genetisch (unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren) hergestellt wurden, um Cyclin E2-Polypeptide, Fragmente, Varianten oder Derivate zu exprimieren und sekretieren, in die Patienten zugeführt werden. Solche Zellen können menschliche Zellen sein und können vom eigenen Gewebe des Patienten stammen oder aus einer anderen Quelle, welche entweder human oder nichthuman ist. Optional können die Zellen immortalisiert sein. Jedoch ist es bevorzugt, um die Chance der immunologischen Antwort zu vermindern, dass die Zellen verkapselt sind, um die Infiltration der umgebenden Gewebe zu vermeiden. Die verkapselten Materialien sind typischerweise biocompatible, semipermeable Polymere Umhüllungen oder Membrane, welche die Freisetzung des Protein-Produktes (der Protein-Produkte) ermöglichen, jedoch den Abbau der Zellen durch das Immunsystem des Patienten oder andere schädliche Faktoren des umgebenden Gewebes vermeiden.
  • Verfahren, verwendet zum Membran-Verkapseln von Zellen sind dem Fachmann vertraut und die Herstellung von verkapselnden Zellen und ihre Implantation in Patienten kann realisiert werden, ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand. Siehe beispielsweise US Patent Nr. 4,892,538; 5,011,472 und 5,105,627. Ein System zum Verkapseln lebender Zellen wird beschrieben in PCT WO91/10425 (Aebischer et al.). Techniken zum Formulieren einer Vielzahl anderer verzögernder oder kontrollierter Zufuhr-Mittel, wie z.B. Liposom Carrier, Bio-erodierbare Partikel oder Beads sind den Fachleuten auf dem Gebiwet auch bekannt und werden beispielsweise beschrieben in US Patent Nr. 5,653,975 (Baetge et al., CytoTherapeutics, Inc.). Die Zellen, mit oder ohne Verkapselung können implantiert werden in geeignete Körpergewebe oder Organe des Patienten.
  • Wie oben diskutiert, mag es wünschenswert sein, isolierte Zellpopulationen wie z.B. Stammzellen, Lymphocyten, rote Blutzellen, Chondrocyten, Neuronen und dergleichen mit Cyclin E2 zu behandeln. Dies kann realisiert werden durch Exponieren der isolierten Zellen gegen Cyclin E2-Protein auf direktem Wege, wobei das Cyclin E2 in einer Form vorliegt, welche permeabel für die Zellmembran ist. Alternativ kann Gentherapie eingesetzt werden, wie oben beschrieben.
  • Eine Art und Weise, in welcher die Gentherapie angewandt werden kann, ist der Cyclin E2 einzusetzen (entweder genomische DNA, cDNA und/oder synthetische DNA kodierend Cyclin E2 oder ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat davon), welches operabel verknüpft mit einem konstitutiven oder induzierbaren Promotor sein kann, um ein "gentherapeutisches DNA-Konstrukt" auszubilden. Der Promotor kann homolog oder heterolog mit dem endogenen Cyclin E2-Gen sein, vorausgesetzt, dass er aktiv in der Zelle oder im Zellgewebe ist, in welche (welches) das Konstrukt insertiert werden wird. Andere Komponenten des gentherapeutischen DNA-Konstruktes können optional DNA-Moleküle, konzipiert zur ortsspezifischen Indikation – je nach Bedarf – (beispielsweise endogene flankierende Sequenzen einsetzbar zur homologen Recombination), gewebsspezifische Promotor-Enhancer oder Silencer, DNA-Moleküle, welche in der Lage sind, einen selektiven Vorteil über die parentalen Zellen zur Verfügung zu stellen, DNA-Moleküle bedeutsam als Label, um transformierte Zellen zu identifizieren, negative Selektionssysteme, zellspezifische Bindungsagenzien (wie z.B. zum Zell.-Targeting), zellspezifische Internalisationsfaktoren und Transkritionsfaktoren um die Expression durch einen Vektor zu verstärken wie auch Faktoren, um die Vektorherstellung zu ermöglichen, enthalten.
  • Dieses gentherapeutische DNA-Konstrukt kann dann in die Zellen des Patienten (entweder ex vivo oder in vivo) eingebracht werden. Ein anderes Mittel zum Einbringen des gentherapeutischen DNA-Konstruktes ist über virale Vektoren. Geeignete virale Vektoren, welche typischer Weise einer Gentherapie zur Zufuhr von gentherapeutischen DNA-Konstrukten eingesetzt werden, schließen ein, ohne Limitation, Adenoviren, Adenoassoziierte Viren, Herpes Simplex Viren, Lentiviren, Pappilloma Viren und retrovirale Vektoren. Einige dieser Vektoren, zum Beispiel retrovirale Vektoren, werden das gentherapeutische DNA Konstrukt zur chromosomalen DNA der Zellen des Patienten zuführen und das gentherapeutische DNA-Konstrukt kann in die chromosomale DNA integrieren; andere Vektoren werden als Episomen fungieren und das gentherapeutische DNA-Konstrukt wird im Cyctoplasma zurückbleiben. Die Verwendung von gentherapeutischen Vektoren wird beispielsweise beschrieben in US Patent Nr. 5,672,344 (30. Sept. 1997); Kelly et al., University of Michigan), 5,399,346 (21. März 1995); Anderson et al., US Dept. Health and Human Services), 5,631,236 (20. Mai 1997); Woo et al., Baylor College of Medicine) und 5,635,399 (3. Juni 1997; Kriegler et al., Chiron Corp.
  • Alternative Mittel, um Gentherapie-DNA-Konstrukte zu Zellen eines Patienten zuzuführen, ohne die Verwendung viraler Vektoren, schließen ein, ohne Limitation, Liposommediasierten Transfer, direkte Injektion von nackter DNA, rezeptor-mediasierten Transfer (Ligand-DNA-Komplex), Elektroporation, Calcium-Phosphat-Precipitation und Mikropartikel-Bomardierungen (beispielsweise "gen-gun"). Siehe US Patent Nr. 4,970,154 (13. Nov. 1990); Chang, Baylor College of Medicine), WO 96/40958 (19. Dez. 1996; Smith et al., Baylor College of Medicine) 5,679,559 (21. Okt. 1997; Kim et al., University of Utah) 5,676,954 (14. Okt. 1997; Brigham, Vanderbilt University) und 5,593,875 (14. Jan. 1997; Wurm et al., Genentech).
  • Ein weiteres Mittel, um die endogene Cyclin E2-Expression in einer Zelle über Gentherapie zu vergrößern, ist es, ein oder mehrere Enhancer-Elemente in die Cyclin E2-Promotoren zu insertieren, wobei das Enhancer-Element (die Enhancer-Elemente) dazu dienen kann (können), die transkriptionale Aktivität des Cyclin E2-Gens zu verbessern. Das (die) Enhancer-Element(e) wird (werden) zum Einsatz ausgewählt, basierend auf dem Gewebe, in welchem man wünscht, Cyclin E2 zu aktivieren; Enhancer-Elemente, von denen man weiß, dass sie Promotor-Aktivierung in einem gegebenen Gewebe verleihen, werden ausgewählt. Beispielsweise kann, falls Cyclin E2 in T-Zellen "eingeschaltet" werden soll, das Ick-Promotor-Enhancer-Element verwendet werden. Hier kann der funktionelle Teil des transkriptionalen Elementes welches hinzugefügt werden soll, in ein Fragment von DNA insertiert werden, enthaltend den Cyclin E2-Promotor (und optional einen Vektor, wie 5' und/oder 3' flankierende Sequenzen etc.) unter Verwendung von Standard-Klonierungs-Technik. Dieses Konstrukt bekannt als ein "homologes Recombinations-Konstrukt" kann dann in die gewünschten Zellen eingebracht werden, entweder ex vivo oder in vivo.
  • Gentherapie kann verwendet werden, um die Cyclin E2-Expression durch Modifizieren der Nukleotid-Sequenz des endogenen Cyclin E2-Promotors zu vermindern. Solche Modifikation wird typischer Weise realisiert über die homologen Rekombinationsverfahren. Beispielsweise kann ein DNA-Molekül enthaltend alle oder einen Teil der Cyclin E2 Promotor-Sequenz technisch erzeugt werden, um Stücke des Promotors, der die Transkription reguliert, zu entfernen und/oder zu ersetzen. Hier kann die TATA-Box und/oder die Bindungsstelle eines transkriptionellen Aktivator-Proteins des Cyclin E2-Promotors deletiert werden unter Verwendung von Standard-molekularbiologischen Techniken; solche Deletion kann die Promotoraktivität inhibieren und dadurch die Transkription des korrespondierenden Cyclin E2-Gens unterdrücken. Die Deletion der TATA-Box oder der Transkriptions-Aktivator-Bindungsstelle in einem Promotor kann realisiert werden durch Erzeugen eines DNA-Konstruktes umfassend den gesamten oder den relevanten Anteil des Cyclin E2-Promotors (von der gleichen oder einer verwandten Spezies des zu regulierenden Cyclin E2-Gens), in welchem ein oder mehrere der TATA-Box-und/oder transkriptionellen Aktivator-Bindungsstellen-Bindungsnukleotide über Substitution, Deletion und/oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden mutiert worden sind, so dass die TATA-Box und/oder die Aktivator-Bindungsstelle eine verminderte Aktivität aufweist oder vollständig inaktiv gemacht wird.
  • Dieses Konstrukt wird typischer Weise zumindest 500 Basen von DNA enthalten, welche mit den nativen (endogenen) 5' und 3' flankierenden Regionen des Promotorsequenz, welches modifiziert worden ist, korrespondieren, und kann in die geeigneten Zellen (entweder ex vivo oder in vivo) entweder direkt oder über ein viralen Vektor wie oben beschrieben eingebracht werden. Typischer Weise wird die Integration des Konstrukts in die genomische DNA der Zellen über homologe Rekombination erfolgen, wobei die 5' und 3' flankierenden DNA-Sequenzen in dem Promotor-Konstrukt dazu dienen können, zu helfen, die modifizierte Promotor-Region über Hybridisierung an die endogene chromosomale DNA zu integrieren.
  • Andere gentherapeutische Verfahren können auch eingesetzt werden, wo dies wünschenswert ist, um die Cyclin E2-Aktivität zu inhibieren. Beispielsweise können Antisense-DNA oder -RNA-Moleküle, welche eine Sequenz aufweisen, die zumindest zu einem Teil mit Cyclin E2 komplementär sind, in die geeignete Zelle eingebracht werden. Typischer Weise wird dieses Antisense-Moleküle komplementär mit der Anfangs-Stelle (5'-Ende) des Cyclin E2-Gens sein. Wenn das Antisense-Molekül dann mit der Cyclin E2 mRNA hybridisiert, wird die Translation der Cyclin E2 mRNA verhindert.
  • Alternativ kann die Gentherapie eingesetzt werden, um einen dominant-negativen Inhibitor von Cyclin E2 zu erzeugen. In dieser Situation kann die DNA codierend eine Volllängenmutante oder ein trunktiertes Polypeptid von Cyclin E2 erzeugt werden und eingebracht werden in die Zellen eines Patienten unter Verwendung entweder von viralen oder nicht-viralen Verfahren wie oben beschrieben. Die Cyclin E2-Mutante ist typischerweise so konzipiert, dass sie
    • (1) mit endogenen Cyclin E2 in ihrer biologischen Rolle konkurriert; und
    • (2) eine oder mehrere Insertionen, Deletionen und/oder Matationen im Vergleich zum Wild-Typ-Cyclin E2 enthält, so dass sie immer noch an Cdk2 bindet, jedoch nicht die Ausbildung eines aktiven Cyclin E2/Cdk-Komplexes ermöglicht (siehe beispielsweise Diehl et al., Mol. Cell. Biol., 17: 7362–7373 (1997)).
  • Dieses mutierte Cyclin E2-Protein, welches in den Zellen überexprimiert wird, in welche es eingebracht wird, kann mit endogenem Cyclin E2-Protein konkurrieren, was in der Ausbildung von mutierten Cyclin E2/Cdk2-Komplexen resultiert, welche inaktiv sind.
  • Biologie von Cyclin E2
  • Obwohl es nicht gewünscht ist, an irgend eine Theorie gebunden zu sein, wird davon ausgegangen, dass Cyclin E2 in vivo dazu dient, mit Cyclin-abhängiger Kinase 2 ("Cdk2"), einen Komplex auszubilden, um ein "Holoenzym" auszubilden; dieses Holoenzym kann dann phosphoryliert werden an der Stelle 160 (Threonin) von Cdk2 durch einen separaten Enzym-Komplex mit der Bezeichnung "Cyclin-aktivierende Kinase" oder "Cak". Nach Posphorylierung des Cdk2-Teils des Cyclin E2/Cdk-Holoenzym-Komplexes kann dieser Komplex dann seine Substrate phosphorylieren, welche Retinoblastom und Histon H1 sind und zwar über die Kinase-Aktivität des Cdk2-Anteils des Holoenzyms.
  • Assays, um nach Inhibitoren von Cyclin E2 zu scrennen
  • Organische (biologische oder synthetische) oder anorganische Moleküle, welche Cyclin E2 inhibieren, können identifiziert werden unter Verwendung von einem oder mehreren der Screening-Assays wie unten beschrieben. Solche Moleküle können verabreicht werden, entweder in einer in vivo oder ex vivo Art und Weise oder einer in vivo Art und Weise durch ein Implantationsgerät oder dergleichen.
  • Aus Gründen der Einfachheit des Lesens wird die folgende Definition hier verwendet, zum Beschreiben der Assays:
    "Test-Molekül(e)" bezieht sich auf das/die Molekül(e), welche(s) untersucht wird (werden) als ein Inhibitor von Cyclin E2, entweder auf Grund seiner potentiellen Fähigkeit (1) die Interaktion von Cyclin E2 mit Cyclin-abhängigen Kinase ("Cdk2"; einem Molekül, mit welchem es natürlicherweise in der Zelle assoziiert ist; siehe die hier aufgeführten Beispiele) zu blockieren; oder (2) die Interaktion von Cyclin E2/Cdk2 mit Cyclinaktivierender Kinase ("Cak"; einem Molekül, welches den Cyclin E2/Cdk2-Komplex durch Phoasphorylierung von Cdk an der Position 160 aktiviert, jedoch nur wenn Cdk2 mit Cyclin E2 komplexiert ist), zu blockieren.
  • A. In vitro Assays unter Verwendung aufgereinigter Proteine
  • Ein Typ eines in vitro Assays zum Evaluieren der Effizienz eines Cyclin E2-Inhibitor-Testmoleküls benötigt aufgereinigtes Cyclin E2 und Cdk. Cyclin E2-Polypeptide und Cdk-Polypeptide können rekombinant erzeugt werden unter Verwendung von oben beschriebenen Verfahren. Das Gen kodierend Cdk2 ist bekannt (Ninomiya-Tsuji et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9006–9010 (1991); Tsai et al., Nature 353: 174–177 (1991)). Rekombinantes Cyclin E2 und Cdk2-Polypeptide können Volllängen-Moleküle sein oder biologisch aktivierte Varianten oder Derivate davon. Wirtszellen zur rekombinanten Erzeugung eines jeden Polypeptids schließen, ohne Einschränkung Bakterien, wie z.B. E-coli, Hefe, Insektenzellen (unter Verwendung beispielsweise des baculoviralen Systems), Säugetier-Zellen, oder andere eukaryotische Zellen ein. Die beiden Polypeptide können coproduziert werden in der gleichen Wirtszelle, wobei die Wirtszelle mit DNA codierend jedes Polypeptid transfiziert wird, oder in separaten Wirtszellen der gleichen oder einer unterschiedlichen Spezies.
  • Jedes Polypeptid kann aufgereinigt werden aus der Wirtszelle (oder aus dem Kulturmedium, falls es sekretiert wird); typischer Weise wird dies realisiert werden durch Exprimieren eines jeden Polypeptids mit einer "Tag"-Sequenz, wie z.B. Hemaglutin ("HA"), His (Polyhistidin wie z.B. Hexahistidin), myc oder FLAG und Aufreinigen des Tag-Polypeptids über eine Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung beispielsweise einer Nickel-Säule für Polyhistidin, oder eines monoclonalen oder polyclonalen Antikörper für myc oder FLAG.
  • Wie oben erwähnt, muss der Cdk-Teil des Cyclin E2/Cdk2-Holoenzyms phosphoryliert werden an der Aminosäure 160, damit das Holoenzym Kinase-Aktivität aufweist; Phosphorylierung der Cdk Aminosäure 160 kann nur auftreten, wenn Cdk mit Cyclin E2 assoziiert ist, wodurch das Holoenzym gebildet wird. Der Cyclin E2/Cdk-Komplex kann spontan ausgebildet werden, falls die beiden Polypeptie in eukaryotische oder prokariotischen Wirtszellen co-exprimiert werden. Des weiteren kann bei Co-Expressionen in einer eukaryotischen Wirtszelle die Maschinerie der Wirtszelle die Cdk Aminosäure 160 phosphorylieren, vorausgesetzt dass, die Wirtszelle eine endogene Cyclin-aktivierende Kinase ("Cak"), aufweist, welche verantwortlich für die Phosphorylierung ist. Der phosphorylierte Holoenzym-Komplexe (der "aktivierte Holoenzym-Komplex") kann dann aufgereinigt werden, typischer Weise unter Verwendung von Affinitäts-Chromatographie.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Erzeugen des aktivierten Holoenzym-Komplexes ist das baculovirale System, wie z.B. das pFast Bac DUAL® (Gibco/BRL Life Technologies, Grand Island, NY). In diesem System können sowohl Cdk als auch Cyclin E2-Gene auf dem gleichen Vektor exprimiert werden und der Vektor enthält auch ein polyHis-Tag zur Erleichterung der Aufreinigung.
  • Falls die beiden Polypeptide in separaten Wirtszellen in der gleichen oder unterschiedlichen Spezies exprimiert werden, können sie aufgereinigt werden (vorzugsweise über Affinität-Chromatographie) und anschließend vereinigt werden in Lösung, um den Holoenzym-Komplex auszubilden. ATP und Cak (Cyclin-abhängig aktivierende Kinase) können dann hinzugegeben werden zum Holoenzym-Komplex; die Aminosäure Threonin 160 von Cdk kann dann phosphoryliert werden über Cak, wodurch ein aktiver Holoenzym-Komplex erzeugt wird. Sobald der aktive Holoenzym-Komplex erzeugt worden ist und isoliert worden ist, können verschiedene in vivo Assays für Cyclin E2-Inhibitoren durchgeführt werden.
  • In einem solchen Assay wird der aktive Holoenzym-Komplex in Lösung platziert. Gamma-gelabeltes ATP (wie z.B. 32P-ATP), Holoenzym-Substrat (wie z.B. Histon H1 oder Retinoblastom-Peptid) und das Testmolekül (die Testmoleküle) können zur Lösung hinzugegeben werden, entweder gleich oder nacheinander. Nach einem Zeitraum der Inkubation kann das Substrat isoliert werden und auf die Menge des enthaltenen Labels untersucht werden.
  • In einem bevorzugten Assay mit der Bezeichnung "scintillation proximity assay" oder "SPA" (Cook, Drug Discovery Today, 1: 287–294 (1996), wird biotinyliertes Substrat (beispielsweise Histon H1 oder Retinoblastom-Peptid) an nicht-poröse Beads angebunden, welche mit Streptavidin gecoatet sind, und mit einer Scintillations-Flüssigkeit aufgefüllt. Die Beads können mit aktivem Holoenzym-Komplex, Gamma-gelabeltem ATP und dem Testmolekül (den Testmolekülen) unter Verwendung von Mikrotiter-Platten (wie z.B. 96 Wellplatten oder 384 Platten) inkubiert werden. Wenn eine Radiogelabelte Phosphatgruppe auf das Substrat über die Kinase-Aktivität des aktiven Holoenzym-Komplexes transferiert wird, wird das Photon freigesetzt und die radioaktive Phosphatgruppe durch einen Scintillations-Zähler aufgezeichnet. Diejenigen Wells, die Testmoleküle enthalten, welche effektiv beim Inhibieren von Gyclin E2 sind, so dass die Kinaseaktivität des Holoenzym-Komplex zerstört wird, werden weniger nachgewiesene radioaktive Counts aufweisen als Kontroll-Wells.
  • Andere in vitro Assays können auch durchgeführt werden, um Testmoleküle auszuwerten. In einem solchen Assay kann das Substrat an Wells einer Mikrotiter-Platte angebunden werden und ein aktiver Holoenzym-Komplex, Gamma-gelabeltes ATP (oder ein anderes geeignetes Detektions-Agents) und das Testmolekül (die Testmoleküle) können nacheinander oder zur gleichen Zeit zugegeben werden. Nach einer kurzen Inkubation (in der Größenordnung von Sekunden bis Minuten) kann die Lösung entfernt werden aus jedem Well und die Platten können gewaschen werden und anschließend auf die Menge von gelabeltem Gamma-Phosphat, hinzugegeben zum Substrat durch die Aktivität des Holoenzym-Komplexes, gemessen werden.
  • Andere Variationen von diesen Assays werden dem gewöhnlichen Fachmann offensichtlich sein. Beispielsweise kann das Substrat an Beads angebunden werden, als eine Alternative, um es auf dem Boden eines jeden Wells anzubinden; die Beads können dann aus der Lösung entfernt werden nach Inkubation mit dem Testmolekül, gelabeltem ATP und aktivem Holoenzym-Komplex und Messen der Menge an Label eingebracht in das Substrat.
  • Typischerweise wird in jedem Typ des Assays das Testmolekül über einen Bereich von Konzentration ausgewertet und eine Serie von geeignete Kontrollen kann verwendet werden, um eine akkurate Auswertung der Ergebnisse zu gewährleisten. In einigen Fällen mag es sinnvoll sein, zwei oder mehr Testmoleküle zusammen auszuwerten, um auf die Möglichkeit von "synergistischen" Effekten zu untersuchen.
  • B. In vitro Assays unter Verwendung von kultivierten Zellen
  • Kultivierte eukaryotische Zelllinien, welche sich aktiv teilen, können eingesetzt werden, um auf die Effizienz eines Testmoleküls hinsichtlich der Inhibition von Cyclin E2 zu untersuchen. Bevorzugte Zelllinien sind diejenigen wie z.B. Säugetier-Saos-2-Zellen (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA, USA; Zugangsnummer HTB-85) und menschliche embryonale Nieren-293T Zellen (American Type Culture Collection, Zugangsnummer CRL-1573), welche nachweisbare Speigel an Cyclin E2, Cdk und Cak exprimieren. Jedoch werden aktiv-teilende Zellen, in welche die Gene codierend Cyclin E2 und/oder Cdk transferiert werden, und in einem nachweisbaren Spiegel exprimiert werden, welche jedoch endogenes Cak exprimieren (oder in welchen Cak-Gene auch transfektiert und exprimiert sind), auch für die Anwendung in diesen Assays geeignet sein.
  • Zelluläre Kulturen können exponiert werden, um das Testmolekül (die Testmoleküle) für einen vorbestimmten Zeitraum (üblicherweise bis hin zu 24 Stunden) zu testen. Die Zellen können gewaschen werden, um das verbleibende Testmolekül zu entfernen und anschließend auf ihre Fähigkeit, sich zu teilen, gemessen werden. Aktiv-teilende Zellen können in verschiedenen Art und Weisen identifiziert werden. Ein bevorzugter Weg ist es, sie für eine kurze Zeit in einer Verbindung zu inkubieren, wie z.B. Brom-Deoxyuridin (BRDU), ein Nukleotid-Analog, das in DNA bei der Replikation eingebracht wird; BRDU kann nachgewiesen werden unter Verwendung eines Fluoreszenz-gelabelten Antikörpers.
  • Alternativ oder zusätzlich können sich teilende Zellen nachgewiesen werden, unter Verwendung von Alamar Blue Assay® (Biosource Intl., Camarillo, CA). Effektive Testmoleküle werden diejenigen sein, mit einer verminderten Zahl an Zellteilung im Vergleich zu Kontroll-Assays.
  • Obgleich nicht gewünscht ist, an irgendeinen speziellen Mechanismus der Wirkweise gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Inhibierung von Cyclin E2 zum Zelltod führen kann oder zur Apoptose. Folglich können kultivierte Zellen, welche einem oder mehreren Testmolekülen ausgesetzt wurden, auch hinsichtlich des Überlebens durch die Anwendung von Trypan Blau oder einem anderen Farbstoff-oder fluoreszierenden Mo lekülen, welche selektiv ausgeschlossen sind, oder aufgenommen werden durch die Lebende Zelle, ausgewertet werden.
  • Andere zellbasierende Assays zum Nachweis der Testmolekül-Effizienz werden für den gewöhnlichen Fachmann leicht offensichtlich sein.
  • Die Assays können durchgeführt werden, unter Verwendung von 96 Well-Mikrotiter-Platten oder anderen geeigneten Platten, welche erlauben, dass verschiedene Assays durchgeführt werden. Typischerweise wird in jedem Typ des Zell-Kultur-Assays das Testmolekül über einen Bereich von Konzentration ausgewertet und eine Serie von "Kontroll-Wells" welche entweder die Testmoleküle nicht aufweist, oder die kultivierten Zellen, kann verwendet werden, um die Akkuranz bei der Auswertung der Ergebnisse sicherzustellen. In einigen Fällen mag es sinnvoll sein, zwei oder mehrere Testmoleküle gleichzeitig auszuwerten, um auf die Möglichkeit eines "synergistischen" Effektes zu untersuchen.
  • C. In vivo Assays
  • Sobald Testmoleküle identifiziert worden sind, können sie hinsichtlich ihrer Effizienz in Nagetier-Tumor-Modellen untersucht werden (siehe beispielsweise O'Reilly et al., Cell, 88: 277–285 (1997)). Das Testmolekül kann verabreicht werden vor dem Tumor-Anschalten in dem Nagetier; nach einer solchen Verabreichung kann das Auftreten des Tumors überwacht werden mit einem Kontroll-Nagetier verglichen werden, welches das Testmolekül nicht empfängt. Alternativ kann das Testmolekül nach dem Einschalten des Tumors verabreicht werden, und die Tumorgröße kann überwacht werden.
  • Die folgenden Beispiele sind eigentlich zum Zweck der Illustration gedacht und sollten nicht so konstruiert werden, als dass sie den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise limitieren.
  • Beispiele
  • 1. Identifikation von menschlichem Cyclin E2
  • Eine Amgen, Inc. interne EST ("expressed sequence tag") Datenbank, enthaltend cDNAs von mehr als 200 verschiedenen Bibliotheken wurde durchsucht unter Verwendung einer Peptid-Sequenz, konzipiert, um Cyclin box-artige Domainen zu identifizieren.
  • Ein marines EST genannt BmmE7-133-G12 wurde aus dieser Suche erhalten, und wurde verwendet, um die öffentliche Datenbank Genbank zu durchsuchen, welche menschliche DNA-Sequenzen enthält. Eine Sequenz, Zugangsnummer R84331, wurde erhalten. Diese Sequenz wurde verwendet, um PCR Primer zu konzipieren, um eine Transkriptions-Untersuchung durchzuführen.
  • Die Transkriptions-Untersuchung wurde durchgeführt durch PCR unter Verwendung von verschiedenen Marathon® cDNA Bibliotheken (Clontech, Palo Alto, CA) mit den folgenden Primern:
  • Figure 00420001
  • Die Bedingung für die PCR waren: 2,5 μl cDNA, 20 pmol eines jeden Primers, 0,5 μl 50 × dNTPs, 0,5 μl AmpliTaq® Enzym (Perkin Elmer), 2,5 μl an 10 × PCR Puffer in einem Endvolumen von 25 μl. Die Cyclus-Parameter waren 94°C für 2 Minuten, gefolgt von 35 Cyclen bei 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 45 Sekunden gefolgt von 72°C für 7 Minuten nach dem letzten Cyclus. Fetale Leber-, fetale Lungen-und Thymus-cDNAs waren positiv für das Cyclin Transkript.
  • Die PCR einer fetalen Leber-Marathon cDNA Bibliothek® wurde verwendet, um die vollständig kodierende Region des Cyclin E2 Gens zu erhalten. Die sense-und anti-sense-Primer für diese Reaktion waren die folgenden:
  • Figure 00420002
  • Die Bedingungen für die PCR waren: 2,5 μl cDNA, 5 pmol eines jeden Primers, 0,5 μl 50 × dNTPs, 0,5 μl KlenTaq® Polymerase (Clontech, Palo Alto, CA), 2,5 μl an 10 × PCR Puffer in einem Endvolumen von 25 μl. Die Cyclus-Parameter waren 94°C für 1 Minuten, gefolgt von 35 Cyclen bei 94°C für 30 Sekunden, gefolgt von 68°C für 3 Minuten. Die PCR-Produkte wurden dann auf einem 1%-Agarose-Gel laufen gelassen. Ein PCR-Produkt von ungefähr 2,58 Kilo-Basenpaar (kb) wurde vom Gel abgeschnitten und die Gel-Schnitte wurden in Natrium-Iodid aufgelöst und bei ungefähr 48°C für 1 Stunde inkubiert. Die DNA wurde dann extrahiert und aufgereinigt unter Verwendung von GeneClean® Kit (Rio 101, Vista, CA)) entsprechend dem Protokoll des Herstellers und in den Vektor pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ligiert. Dieser Vektor enthaltend das Inser wurde dann in E. coli Inv-alpha-f Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA) zur Amplifikation transformiert. Das Plasmid wurde aufgereinigt aus den Zellen unter Verwendung des standardisierten alkalinischen Lysis-Verfahrens mit dem Qiagen Max1® Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA) und das Insert wurde sequenziert. Das Sequenzieren zeigte, dass das Insert die Volllängen menschliche Cyclin E2 cDNA enthielt.
  • Um zu bestätigen, dass das erhaltene Sequenz korrekt war, wurde PCR durchgeführt unter Verwendung einer Hochpräzisions-Polymerase wie folgt. Fetale Lungen-und Thymus-Marathon Libraries® (Clontech) wurden als Templat verwendet und die Primer für diese Reaktion waren:
  • Figure 00430001
  • Die Bedingungen für die PCR waren: 2,5 μl cDNA, 5 pmol eines jeden Primers, 0,5 μl 50 × dNTPs, 0,5 μl PFU-Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA), 2,5 μl an 10 × PCR Puffer in einem Endvolumen von 25 μl. Die Cyclus-Parameter waren 94°C für 2 Minuten, gefolgt von 35 Cyclen bei 94°C für 30 Sekunden, gefolgt von 68°C für 3 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 3 Minuten. Die resultierende ungefähr 1,3 kb DNA-Bande wurde auf einem Agarose-Gel aufgelöst und wie oben beschrieben aufgereingt. Das aufgereinigte DNA-Produkt wurde in pCR2.1 wie oben beschrieben subcloniert.
  • Verdauung von 2 unabhängigen Klonen mit dem Restrictionsenzym EcoRI förderte ein Fragment von ungefähr 1,3 kb zu Tage und ein Fragment von ungefähr 1,2 kb. Die Sequenzanalyse von beiden Fragmenten förderte einen Volllängen Cyclin E2-Klon (das 1,3 kb-Fragment) zu Tage und eine Cyclin E2-Mutante (das 1,2 kb Fragment) mit einer im- Rahmen-Deletion von ungefähr 135 by in der Cyclin-Box, nicht aufweisend die Basen 496–631 des Volllängen-Klons.
  • Die Sequenz der menschlichen Volllängen Cyclin E2 cDNA ist in 1 dargestellt (SEQ ID NO: 1) und die putative Aminosäure-Sequenz, wie von dieser cDNA translatiert, ist dargestellt in 3 (SEQ ID NO: 3). Die cDNA der Splice-Variante ist in 7 dargestellt (SEQ ID NO: 5) und die Aminosäure-Sequenz dieser Splice-Variante ist dargestellt in 6 (SEQ ID NO: 6).
  • Die Analyse dieses Gens und der Vergleich mit Genen der Datenbank wie oben dargestellt, zeigte, dass es ein neues Gen darstellte mit ungefähr 49% insgesamter Identität sowohl auf der DANN-als auch der Aminosäure-Sequenz-Ebene, bei einem Vergleich der menschlichen Cyclin E1 und ungefähr 70% Identität zu Cyclin-Box-Domaine von menschlichem Cyclin E1 auf der Aminosäure-Ebene. Auf Grund der Homologie mit Cyclin E1, wurde bestimmt, dass dieses Gen ein Mitglied der Cyclin-Familie war. Folglich wurde es als "Cyclin E2" bezeichnet.
  • Der Cylin E2-Mutanten-Klon, welcher eine im-Rahmen-Splice-Variante ist, weist die Aminosäuren 166–212 nicht auf (Basen 496–631), welche innerhalb der Cyclin-Box lokalisiert sind. Wie unten im Detail beschrieben, bindet diese Isoform nicht an cdk2.
  • Eine Suche dieser menschlichen Cyclin E2 cDNA-Sequenz mit den externen, öffentlich verfügbaren Datenbanken, wie z.B. Genbank, förderte ein EST in der Datenbank zu Tage, welches eine Homologie mit dem 5' Ende von menschlichen Cyclin E2 (Genbank, Zugangsnummer R84331) aufweist. Jedoch weist diese Genbank-Sequenz verschiedene unkorrekte Basen auf, wenn sie mit dem gleichen Stück an Nukleotiden in der vorliegenden Erfindung verglichen werden.
  • 2. Klonieren von murinem Cyclin E2
  • Das murine EST BmmE7-133-G12 wie oben beschrieben, wurde verwendet, um die folgenden PCR-Primer zu konzipieren:
  • Figure 00440001
  • Eine Maus-Gehirn Marathon Library® cDNA (Clontech, Palo Alto, CA) wurde als das PCR Templat verwendet. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: 5 μl cDNA, 20 pmol eines jeden Primers, 0,5 μl 50 × dNTPs, 0,5 μl AmpliTaq® (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ) und 5 μl an 10 × PCR Puffer in einem Endvolumen von 50 μl. Die Reaktions-Parameter waren 94°C für 2 Minuten, gefolgt von 35 Cyclen bei 94°C für 20 Sekunden, gefolgt von 60°C für 30 Sekunden, 72°C für 50 Sekunden und ein Halten bei 72°C für 7 Minuten nach dem letzten Cyclus. Das PCR-Produkt war ein Fragment von ungefähr 723 bp und enthielt Reste 308 bis 1031. Dieses Fragment wurde in pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert und wurde in E. coli-Zellen wie oben beschrieben transformiert. Nach Kultivieren der Zellen, um das Plasmid zu amplifizieren, wurde das Plasmid aus den Zellen wie oben beschrieben aufgereinigt und das ungefähr 723 by Insert wurde mit EcoRI verdaut, welches ein ungefähr 153 bp-Fragment (Rest 879–1031) erzeugte sowie ein ungefähr 570 by (Reste 308–878) Fragment erzeugte. Das 570 bp-Fragment wurde Gel-aufgereinigt und unter Verwendung der oben beschriebenen Prozeduren und wurde verwendet als eine DNA-Sonde, um eine Uni-Zap® Maus-Testis-XR-Bibliothek (Stratagene, La Jolla, CA, Katalog Nr. 937308) zu screenen. Die Bibliothek wurde auf ungefähr 1 × 10(6) PFUs (Plaque-bildende Einheit, plaque forming units) platiert und Duplikat-Plaque-Erhebungen wurden hergestellt unter Verwendung von geladenen Nylon-Membranen (BioRad, Hercules, CA). Die Maus-Cyclin E2 570 by Sonde wurde radiogelabelt unter Verwendung des Rediprimer® Kit (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) folgend dem Protokoll des Herstellers. Die spezifische Aktivität der Sonde war nur etwa 1 × 10(9) cpm/microgramm. Hybridisierung der Filter wurde durchgeführt über Nacht bei ungefähr 42°C in einer standardisierten Hybridisierungslösung enthaltend 2,5 × Denhardt's Lösung, 50% Formamid, 0,1% SDS, 5 × SSC und 0,1 mg/ml Lachssperma -DNA. Nach Hybridisieren wurden die Filter gewaschen, zweimal und in 2 × SSC bei Raumtemperatur für ungefähr 15 Minuten, gefolgt von drei Waschungen in 2 × SSC bei 50°C für ungefähr 30 Minuten und dann ein Mal in 0,2 × SSC plus 0,5% SDS bei ungefähr 42°C für 30 Minuten. Die Filter wurden dem Film bei ungefähr minus 70°C für ungefähr 3 Tage exponiert unter Verwendung von intensivierenden Screens.
  • Sechs Positive wurden identifiziert aus diesen Hybridisierung-Screens. Das Insert eines jeden Klons wurde in den Vektor pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert unter Verwendung einer Standard-Technik und jedes Insert wurde sequenziert.
  • Die Sequenz der munnen Cyclin E2 cDNA ist in 2 dargestellt (SEQ ID NO: 2). Die putative Aminosäure-Sequenz, wie von dieser cDMA translatiert, ist in 4 dargestellt (SEQ ID NO: 4). Murines Cycliln E2 zeigt ungefähr 89% Identität mit menschlichem Cyclin E2 auf der DNA-Ebene und ungefähr 92% Identität zu menschlichem Cyclin E2 auf der Aminosäure-Ebene.
  • 3. Menschliche Cyclin E2 Protein Herstellung
  • Volllängen menschliches Cyclin E2 Polypeptid wurde hergestellt als ein Glutathion-s-Transferase-Fusions-Protein unter Verwendung von pGEX® System (Pharmacia, Piscataway, NJ) und folgend dem Protokoll des Herstellers. Die Cyclin E2 cDNA wurde in einen Vektor pGEX-4T-2 insertiert am 3'-Ende der DNA, welche GST codiert. Der Vektor wurde in E-coli-Stamm BL-21-Zellen (Invitrogen, San Diego, CA) transformiert, welche transformationsbefähigt waren durch Mischen von Plasmid DNA in den Zellen. Nach Kultivieren der Zellen über Nacht wurden die Zellen 1:100 in einem Medium verdünnt und für ungefähr 4 Stunden bei 37°C kultiviert, wonach IPTG in einer letztendlichen Konzentration von 0,1 mM hinzugegeben wurde. Nach ungefähr 4 Stunden des Kultivierens wurde der Protein-Extrakt von den Zellen unter Verwendung des GST Gen-Funsions-System®-Protokoll (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) hergestellt, folgend dem Protokoll des Herstellers, und dieser Extrakt wurde dann zu einer Aufschlemmung von Glutathion-Agarose 4B-Sepharose-Beads (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) hinzugegeben. Der Extrakt-Lösung enthaltend die Beads wurde dann zentrifugiert und die Beads wurden gesammelt und gewaschen. Diese Beads wurden dann mit einer Aufschlemmung von Agarose-Beads, an welche Thrombin-Protease gebunden war (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Nach Mischen und Inkubieren der beiden Sätze an Beads für ungefähr 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde die Lösung zentrifugiert, um die Beads auszufällen. Proben des Überstandes wurden auf SDS-PAGE laufen gelassen, um die Reinheit auszuwerten. Ein Photo von Coomassie-angefärbtem Gel ist in 9 dargestellt. Wie zu sehen, war nur eine einzelne Bande von ungefähr 46 kDa vorliegend; diese Bande korrespondiert mit dem zu erwartenden Molekulargewicht für Cyclin E2, was zeigt, dass die Prozedur in der Erzeugung von aufgereinigtem Cyclin E2-Polypeptid resultiert. Um zu bestätigen, dass diese Band tatsächlich Cyclin E2 war, wurde ein Western-Blot hergestellt und mit Anti-Cyclin E2-Antiserum getestet (unter Verwendung von Antiserum erzeugt gegen das Cyclin E2 Peptid von SEQ ID NO: 17).
  • 4. Erzeugung von menschlichen Cyclin E2-Antikörpern
  • Polyklonales Kaninchen-Antiserum erzeugt gegen zwei Cyclin E2-Peptide wurde wie folgt hergestellt.
  • Peptide korrespondierend zu den beiden Aminosäuren-Sequenzen wurden hergestellt unter Verwendung von standardisiertem Peptid-Synthese-Prozeduren.
  • Figure 00470001
  • Ungefähr 5 mg eines jeden Peptids wurden mit Freund's vollständigen Adjuvants in einem Gesamtvolumen von ungefähr 1 ml vermischt und subcutan in Kaninchen injiziert. Nach ungefähr 4 Wochen wurden die Kaninchen erneut mit der gleichen Lösung injiziert. Nach zwei Wochen wurden die Kaninchen zu Ader gelassen, das Serum wurde auf Antikörper gegen Peptide mit Hilfe eines Western-Blots getestet. Eine dritte Injektion wurde nach dem Test-Blutabzapfen verabreicht und ungefähr drei Wochen später wurde ein zweites Test-Blutabzapfen durchgeführt. Nach ungefähr zwei Wochen später wurde eine dritte Injektion verabreicht und ungefähr zwei Wochen danach wurde die letzte Blutsammlung durchgeführt.
  • Blut, erhalten vom letzten Blutabzapfen, ließ man verklumpen, dadurch dass man es bei ungefähr 4°C für ungefähr 2 Stunden inkubierte. Das Serum wurde dann erhalten durch Zentrifugieren und Einsammeln des Überstandes. Dieses Serum wurde für Western-Blots verwendet und für Immunoprecipitation wie hier beschrieben.
  • 5. Expression von menschlichem Cyclin E2 in Säugetierzellen
  • Menschliche Volllängen-Cyclin E2-cDNA wurde in das Plasmid pEGFP-n1 (Invitrogen, San Diego, CA) insertiert, welche die kodierende Region für Grün Fluoreszierendes Protein ("GFP") enthält. Die Cyclin E2 cDNA wurde 3' in die GFP-DNA insertiert, um den Vektor pGFP-E2 zu erzeugen.
  • Ungefähr 5 Microgramm an Plasmid wurden dann in ungefähr 2 × 10(6) menschliche embryonische Nieren-293T-Zellen unter Verwendung der standardisierten Calcium-Phosphat-Transfektion-Prozedur transfiziert.
  • In ähnlicher Art und Weise wurden die Zellen mit einem Vektor transfiziert, genannt HA-Cdk2, enthaltend das Gen kodierend menschliches Cdk2 (Turner et al., Genes and Devel., 8: 1434–1447 (1994)).
  • Nach Transfektion wurden die Zellen bei ungefähr 37°C für 24 Stunden inkubiert, wonach die Zellen in ungefähr 200 μl eines Puffers mit der Bezeichnung "TG-Puffer" enthaltend 1% Triton X-100, 10% Glycerol, 0,1% SDS, 0,5% Deoxycholat, 20 mM Hepes pH 7,4, 100 mM NaCl und ungefähr 1 mM von jeweils Leupeptin, Aprotinin, PMSF, Natrium-Vanadat und Natrium-Fluorid geerntet. Die Zell-Debris wurde durch Zentrifugation bei ungefähr 10000 × g entfernt, wonach der Überstand eingesammelt wurde und das Pellet verworfen wurde.
  • Zum Extrakt wurde ungefähr 1 μl an Anti-GFP-polyclonalem Antiserum (Invitrogen, San Diego, CA) hinzugegeben und der Extrakt wurde bei ungefähr 4°C für ungefähr 1 Stunde inkubiert. Nach Inkubation wurden ungefähr 50 μl an Protein A/Protein G-Agarose-Beads (Pierce Biochemicals, Rockford, IL) hinzugegeben und die Mischung wurde für ungefähr 30 Minuten bei ungefähr 4°C inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Beads ausgefällt und fünf Mal mit TG-Puffer minus SDS und Deoxycholat gewaschen. Nach Waschen wurden die Beads resuspendiert in standardisiertem SDS-PAGE Proben-Puffer, auf ungefähr 95°C für ungefähr 3 Minuten erhitzt, zentrifugiert, und der Überstand wurde eingesammelt und auf ein 12%-iges SDS-PAGE-Gel geladen.
  • Das Gel wurde auf PVDS-Membran transferriert (NEW Life Science, Burton, MA) unter Verwendung von standardisierter Western-Blot-Prozedur, und die Membran wurde in Streifen geschnitten, um mit verschiedenen Antikörpern zu testen, einschließend Anti-GFP (Invitrogen, San Diego, SA), Anti-HA (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) und Anti-p27 (Santa Cruz Biologicals, Santa Cruz, CA).
  • Davon getrennt wurde die gleiche Prozedur nachfolgend durchgeführt für die menschliche Cyclin E2-Splice-Variante und die gleichen Prozeduren wie diejenigen beschrieben unmittelbar zuvor für die mit Wild-Typ-Cyclin E2 transfektierten Zellen wurde durchgeführt für diese Zellen, um zu bestimmen, ob Cdk eine Splice-Variante bindet.
  • In einem weiteren separaten Satz von Experimenten wurde ein DNA-Konstrukt enthaltend eine cDNA kodierend menschliches p27 (Polyak et al., Cell, 78: 59–66 (1994)) mit den Zellen kotransfiziert, die auch mit Volllängen Cyclin E2 und Cdk2 transfektiert waren. Die Prozeduren für diese Transfektion folgten waren die gleichen wie diejenigen die oben beschrieben sind.
  • Die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse sind in 10A–D dargestellt. Wie in 10A gezeigt, wird GFP-Protein fusioniert entweder an Volllängen-Cyclin E2 oder die Splice-Variante "sv" von Cyclin E2 unter Verwendung von Anti-GFP-Antiserum immunopräzipitiert. Eine IgG schwere Kette wird auch in dem Western-Blot wie angegeben detektiert. 10B zeigt, dass GFP allein auch immunopräzipitiert wird durch das Anti-GFP-Antiserum. 10C zeigt, dass Cdk2 mit Wild-Typ-Cyclin E2 assoziiert (und folglich coimmunoprecipitiert) jedoch nicht mit der Cyclin E2-Splice-Variante und folglich ist der mittlere Teil der Cyclin-Box-Domaine, welcher in der Splice-Variante nicht vorliegt, wahrscheinlich verantwortlich für das Cdk2-Binden an Cyclin E2. 10D zeigt, dass in einer 3-Wege-Transfektion der Zellen mit Cdk2 Cyclin E2 (volllängen-Version) und p27-DNA-Konstrukten p27 mit den anderen beiden Proteinen co-immunopräzipitiert, was zeigt, dass p27 einen Komplex mit Cdk2 und Cyclin E2 ausbilden. 10 E zeigt, dass ein Komplex, enthaltend Volllängen-Cyclin E2 und Cdk2 Histon H1 phosphorylisieren kann und dass das Vorliegen von p27 die Menge der Phosphorylierung vermindert. Darüber hinaus kann der Cyclin E2-Splice-Varianten Cdk2-Komplex das Histon H1 nicht phosphorylieren. Die Experimente für diesen Kinase-Assay wurden durchgeführt wie unmittelbar unten beschrieben.
  • 6. Biologische Aktivität von Cyclin E2
  • Die biologische Aktivität von Cyclin E2/Cdk2 wurde ausgewertet unter Verwendung eines Kinase-Assays. Die Extrakte wurden hergestellt durch Behandeln von ungefähr 2 × 10(6) Saos-2-Zellen (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA, USA) mit ungefähr 200 μl TG-Puffer (siehe oben) und Zentrifugieren der Extrakte, um die zelluläre Debris auszufällen. Ungefähr 3 μl an Antikörpern (entweder Anti-Cyclin E2 erzeugt gegen das Peptid von SEQ ID NO: 17, Anti-GFP, oder preimmunes Serum "PI") wurden zu ungefähr 500 μg an Zell-Extrakt-Protein hinzugegeben und die Mischung wurde ungefähr 1 Stunde bei ungefähr 4°C inkubiert. Ungefähr 50 μl an Protein A/G-Sepharose-Beads wurde dann hinzugegeben und diese Mischung wurde ungefähr 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Beads wurden dann 4 Mal mit TG-Puffer gewaschen (ungefähr 500 μl pro Waschung), wonach Kinase-Puffer enthaltend 50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM ATP und 40 micro-Cl von Gamma-32P-ATP zum Extrakt hinzugegeben wurde. Verschiedene potentielle Kinase-Substrate wurden dann hinzugegeben, einschließend Histon H1, GST-Retinoblastom (pRb; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) oder GST-p53 (Santa Cruz Biotechnology). Die Mischung wurde dann bei ungefähr 37°C für ungefähr 30 Minuten inkubiert, wonach 2 × SDS-PAGE standardisierte Proben-Puffer hinzugegeben wurde. Die Proben wurden auf ungefähr 95°C für 3 Minuten erhitzt, auf SDS-PAGE laufen gelassen und einem Film für 2 Stunden ausgesetzt. Die Ergebnisse können in 15, Panel B betrachtet werden. Wie offensichtlich ist, kann der Cyclin E2-Cdk2-Komplex GST-Rb und Histon H1, jedoch nicht GST-p53 phosphorylieren.
  • 7. Gewebsspezifische Expression von Cyclin E2
  • Northern-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um diejenigen Gewebe zu identifizieren, in welchen Cyclin E2 exprimiert wird. Ein Northern-Blot, enthaltend ungefähr 2 μg an Poly A+ RNA von verschiedenen menschlichen Geweben wurde käuflich erworben (Clontech, Palo Alto, CA) und entweder mit einem ungefähr 320 bp menschlichen Cyclin E2 cDNA-Fragment aufspannend eine Region 5' der Cyclin-Box, einem 310 Basenpaar Cyclin E1-Fragment aufspannend die Aminosäure 272–377 von menschlichen Cyclin E1, oder einem menschlichen GADPH (Glyceraldehyd Phospho-Dehydrogenase) als Sonde von ungefähr 550 bp kodierend einen Teil des menschlichen GADPH-Gens untersucht. Die Sonden wurden gelabelt unter Verwendung des RediPrimer® Kit (Amersham, Arlington Heights, IL) und die letzendliche Aktivität der gelabelten Sonden war ungefähr 1 × 10(9) cpm/μg. Die Blots wurden prähybridisiert ungefähr 2 Stunden und über Nacht hybridisiert bei ungefähr 42°C in einer Hybridisierungslösung enthaltend 2 × Denhardt's, 0,5% SDS, 50% Formamid, 0,1 mg/μg Lachs-Spermen-DNA und 5 × SSC. Spezifische Aktivität der Sonde in dieser Lösung war ungefähr 2 × 10(6) cpm. Nach Hybridisierung wurden die Blots drei Mal in 2 × SSC gewaschen, enthaltend 0,1% SDS bei Raumtemperatur, zweimal in 2 × SSC, enthaltend 0,1% SDS bei 50°C und einmal in 0,1 × SSC, enthaltend 0,5% SDS bei 50°C. Die Filme wurden bei ungefähr –70°C für 2 Tage exponiert. Die resultierenden Autorads wurden in einen Computer gescannt und die Daten wurden in einen Balken-Graph überführt, um die relativen Mengen von nachgewiesener RNA durch jede Sonde zu quantifizieren.
  • Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt und die menschlichen Gewebe, welche analysiert wurden, sind auf der X-Achse dargestellt. Wie zu sehen ist, zeigten Test-Gewebe den höchsten Spiegel sowohl von Cyclin E2 als auch von Cyclin E1 RNA. Cylin E1 RNA lag im peripheralen Blut-Lymphocyt ("PBL") vor, jedoch war dies für Cyclin E2 RNA nicht der Fall. Cylin E2 RNA lag in Milz und Thymus vor, was jedoch für Cyclin E1 RNA nicht der Fall war.
  • Um die Cyclin E2 RNA-Spiegel in Tumorgeweben zu untersuchen, wurden verschiedene Brustkrebs-Zelllinien zusammen mit normalen immortalisierten Brustgewebs-Zellinien untersucht. Die Zelllinien sind in 13 aufgeführt. Alle Zelllinien sind verfügbar von American Type Culture Collection.
  • Die NMEC, 184A1 und MCF10 Zellen wurden in modifiziertem DME/F12 (Gibco/BRL, Grand Island, NY) Medium angereichert mit 10 mM Hepes, 2 mM Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,5 mM Ethanolamin, 5 μg/ml Transferrin, 1 mg/ml Bovin-Serum-Albumin, 5,0 ng/ml Natrium-Selenit, 20 ng/ml Triiodothyronin, 10 ng/ml EGF, 5 μg/ml Insulin und 0,5 μg/ml Hydrocortison kultiviert. Bovin-Hypophysen-Extrakte (30 μg/ml) wurde auch zum Medium im Fall der NMEC-Zelllinien hinzugegeben. Die ER+ und ER– (Estrogen Rezeptor positiven oder negativen) Brustkrebs-Zelllinien wurden in Alpha oder Richter verbessertem minimalen essentiellen Medium (Gibco/BRL, Grand Island, NY) angereichert mit 10 mM Hepes, 2 mM Glutamin, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 10% fetalem Bocin-Serum und 1 μg/ml Insulin kultiviert. Alle Zellen wurden routinemäßig gescreent auf Mycoplasma-Contamination bei 37°C in einer Atmosphäre bei ungefähr 6,5% Kohlendioxid aufbewahrt.
  • Die Gesamtmenge der RNA wurde aus jeder Zelllinie durch Lysieren der Zell-Monolayer in Guanidin-Isothiocyanat hergestellt und durch Zentrifugieren über einem Cesium-Chlorid-Gradienten beschrieben von Gudas et al., (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85: 4705–4709 (19988)). Ungefähr 20 μg an RNA wurde elektrophoresiert auf denaturierenden Formaldehyd-Genen, transferiert auf Magna NT Membranen (Micron Separations Inc., Westboro, MA) und quervernetzt mit UV-Bestrahlung. Die Sonden für Northern-Blot-Analyse enthielten die Volllängen Cyclin E1 cDNA und ein ungefähr 330 bp Fragment an Cyclin E2 (wie oben beschrieben wurde). Die Sonden wurden mit 32P-dCTP gelabelt auf eine spezifische Aktivität von ungefähr 1 × 10(9) cpm/μg DNA unter Verwendung eines zufällig geprimten Labeling-Kits (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN). Der Blot wurde hybridisiert in einer Lösung, enthaltend 50% Formamid, 0,2% SDS, 6 × SSPE, 2 × Denhardt's und 100 ng/ml Lachs-Spermien-DNA. Die Hybridisierung wurde durchgeführt bei ungefähr 41°C für ungefähr 24 Stunden, nach dem Blot ein Mal in 2 × SSC gewaschen, enthaltend 0,5% SDS bei Raumtemperatur; ein Mal in 0,5 × SSC ent haltend 0,5% SDS bei Raumtemperatur; ein Mal in 0,2 × SSC enthaltend 0,5% SDS bei Raumtemperatur; und drei Mal in 0,5 × SSC enthaltend 0,5% SDS bei ungefähr 59°C.
  • Die Ergebnisse der Northern-Analyse sind in 13 dargestellt. Wie zu sehen ist, liegt Cyclin E2 RNA in einigen ER+ und einigen ER–-Zelllinien vor, ist jedoch kaum in normalen Zellen nachzuweisen. Cyclin E1 RNA liegt in weniger Brustkrebs-Zellen im Vergleich zu Cyclin E2 vor.
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001

Claims (22)

  1. Ein isoliertes biologisch aktives Cyclin-E2-Nukleinsäure-Molekül kodierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) dem Nukleinsäure-Molekül umfassend SEQ ID Nr. 1; (b) dem Nukleinsäure-Molekül umfassend SEQ ID Nr. 2; (c) dem Nukleinsäure-Molekül umfassend SEQ ID Nr. 5; (d) dem Nukleinsäure-Molekül umfassend SEQ ID Nr. 7; (e) dem Nukleinsäure-Molekül umfassend SEQ ID Nr. 8; (f) einem Nukleinsäure-Molekül kodierend das Polypeptid von SEQ ID Nr. 3 oder ein biologisch aktives Fragment von besagtem Polypeptid; (g) einem Nukleinsäure-Molekül kodierend das Polypeptid von SEQ ID Nr. 4 oder ein biologisch aktives Fragment von besagtem Polypeptid; (h) einem Nukleinsäure-Molekül kodierend das Polypeptid von SEQ ID Nr. 6 oder ein biologisch aktives Fragment von besagtem Polypeptid; (i) einem Nukleinsäure-Molekül, welches ein Polypeptid kodiert, das zumindest 70% identisch ist mit dem Polypeptid kodiert durch SEQ ID Nr. 1; (j) einem Nukleinsäure-Molekül, welches ein Polypeptid kodiert, das zumindest 70% identisch ist mit dem Polypeptid kodiert durch SEQ ID Nr. 5; (k) einem Nukleinsäure-Molekül, welches ein Polypeptid kodiert, das zumindest 70% identisch ist mit dem Polypeptid kodiert durch SEQ ID Nr. 2.
  2. Ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül, das komplementär ist mit dem Nukleinsäure-Molekül von Anspruch 1.
  3. Ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül, umfassend SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 8.
  4. Ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül kodierend das Polynukelotid von SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6.
  5. Ein Vektor umfassend das Nukleinsäure-Molekül von Anspruch 1.
  6. Ein Vektor umfassend die Nukleinsäure von Anspruch 2.
  7. Ein Vektor umfassend die Nukleinsäure von Anspruch 3.
  8. Ein Vektor umfassend die Nukleinsäure von Anspruch 4.
  9. Eine Wirtszelle umfassend den Vektor von Anspruch 5.
  10. Eine Wirtszelle umfassend den Vektor von Anspruch 6.
  11. Eine Wirtszelle umfassend den Vektor von Anspruch 7.
  12. Eine Wirtszelle umfassend den Vektor von Anspruch 8.
  13. Ein Prozess zum Herstellen eines Cyclin-E2-Polypeptids umfassend die Schritte von: (a) Exprimieren eines Polypeptids kodiert durch die Nukleinsäure von Anspruch 1 in einem geeigneten Wirt; und (b) Isolieren des Polypeptids.
  14. Der Prozess gemäß Anspruch 13, worin das Polypeptid SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 6 ist.
  15. Ein Cyclin-E2-Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) dem Polypeptid von SEQ ID Nr. 3; (b) dem Polypeptid von SEQ ID Nr. 4; (c) dem Polypeptid von SEQ ID Nr. 6; und (d) einem Polypeptid, das zumindest 70% identisch ist mit irgendeinem der Polypeptide von (a) bis (c).
  16. Das Cyclin-E2-Polypeptid von Anspruch 15, welches kein Amino-terminales Methionin besitzt.
  17. Ein in vitro-Verfahren zum Steigern der Proliferation einer Zelle umfassend das Exprimieren einer Nukleinsäure kodierend Cyclin-E2 gemäß Ansprach 1 oder eines biologisch aktiven Fragments davon in der Zelle.
  18. Ein in vitro-Verfahren zum Steigern der Zell-Teilung einer Zelle umfassend das Exprimieren eines Gen von Cyclin-E2 von Anspruch 1 oder eines biologisch aktiven Fragments davon in der Zelle.
  19. Ein in vitro-Verfahren zum Vermindern der Zell-Teilung in der Zelle umfassend das Exprimieren einer Cyclin-E2-Mutante des Cyclin E2 Gens von Anspruch 1 in der Zelle, worin die Mutante keine biologische Cyclin-E2-Aktivität aufweist.
  20. Die Verwendung einer isolierten Nukleinsäure gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, einem Vektor gemäß irgendeinem der Ansprüche 5 bis 8, einer Wirtszelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12 oder einem Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 16 zum Herstellen eines Medikaments zum Steigern der Zell-Proliferation und/oder zum Steigern der Zell-Teilung.
  21. Die Verwendung einer Cyclin-E2-Mutante des Cyclin E2 Gens von Anspruch 1, welche keine biologische Cyclin-E2-Aktivität aufweist oder eine Nukleinsäure kodierend selbige zum Herstellen eines Medikaments zum Vermindern der Zell-Teilung, wobei besagte Mutante geeignet zur Expression in einer Zelle ist.
  22. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine isolierte Nukleinsäure gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, einen Vektor gemäß irgendeinem der Ansprüche 5 bis 8, eine Wirtszelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12 oder ein Polypeptid gemäß irgendeinem der Ansprüche 15 bis 16.
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