DE69828793T2

DE69828793T2 - Fluoreszierender polymer-sensor zur erfassung von harnstoff

Info

Publication number: DE69828793T2
Application number: DE69828793T
Authority: DE
Inventors: Christiane Munkholm
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1997-08-05
Filing date: 1998-08-03
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2018-08-04
Also published as: ES2236917T3; US5945343A; WO1999007882A1; EP1000171B1; DK1000171T3; ATE287967T1; AU8354198A; EP1000171A1; DE69828793D1; JP2001512693A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Sensoren zum Nachweis von Harnstoff.
Beschreibung des Standes der Technik Eine Reihe von elektrochemischen Methoden führen eine kontinuierliche Kontrolle von Harnstoff durch (Goldfinch, M.J.; Lowe, C.R. Anal. Biochem. 138: 430 – 436 (1983); Luo, S.; Walt, D.R. Anal. Chem. 61: 1069 – 1072 (1989)). Die Sensoren, die solche Methoden anwenden, werden durch Immobilisieren des Enzyms Urease auf der Oberfläche einer Elektrode erzeugt. Die enzymatische Hydrolyse von Harnstoff produziert Ammoniak und Kohlendioxid, die bei physiologischem pH protoniert werden, um Ammonium- und Carbonat-Ionen zu bilden, die die elektrische Leitfähigkeit der Lösung in Nähe der Elektrode erhöhen.
Harnstoff kann auch unter Verwendung eines optischen Sensors überwacht werden. Die Detektion von Analyten mittels optischer Sensoren erfordert im allgemeinen die Entwicklung von fluoreszierenden Übertragern (Transduktoren), die für verschiedene Analyten spezifisch sind. Optische Übertrager sind ebenfalls mit der Detektion von Harnstoff über die Urease-gesteuerte Hydrolyse von Harnstoff verknüpft worden, wobei der optische Übertrager durch Ammonium oder Ammoniak moduliert wird.
Der Nachweis von Ammonium erfordert einen Ammonium-spezifischen Ionophor, der an einen Chromophor gekoppelt ist, der sein Absorptionsspektrum bei Protonierung verändert, sowie eine lipophile anionische Stelle. Als solche können Sensoren auf der Grundlage des Nachweises von Ammonium teuer und kompliziert sein.
Beispielsweise beschreibt Kawabata et al., Anal. Chim. Acta 283: 689 – 694 (1993) eine Harnstoff-Optrode unter Verwendung einer Polymermembran, die gegenüber Ammoniumionen optisch empfindlich ist, und eine Urease-immobilisierte Membran. Die Ammonium-empfindliche Polymermembran von Kawabata besteht aus einer fluoreszierenden Sonde (positiv geladenes Hexadecyl-Acridin-Orange) und einem Ammonium-Ionophor, der auf Ammonium-Ionen reagiert, die aus der Urease enthaltenden Schicht nach Spaltung von Harnstoff aus der Probe diffundieren. Der fluoreszierende Farbstoff ist auf einer plastifizierten PVC-Membran über eine Polyacrylamidmembran immobilisiert.
Die Detektion von Ammoniak erfordert einen protonierten pH-empfindlichen Indikator (INDH⁺), der sein Absorptionsspektrum oder Fluoreszenzspektrum bei Deprotonierung verändert: INDH⁺ + NH₃ IND + NH₄ ⁺
Die Entwicklung eines Sensors auf der Basis des Nachweises von Ammoniak besitzt ferner einen Nachteil: nämlich die rasche Protonierung von Ammoniak bei physiologischem pH. Der pK_a von Ammonium liegt bei 9,3, was keinen pH darstellt, der die maximale Enzymaktivität unterstützt.
Hydrophobe Polymere, die optisch transparent und für den Analyten von Interesse durchlässig sind, werden mit optischen Sensoren verwendet, wenn es sich bei dem Analyten um einen Dampf oder ein Gas handelt und wenn dieser fähig ist, in eine hydrophobe Membran zu diffundieren. Wenn hydrophobe Polymere mit gewissen fluoreszierenden Farbstoffen verwendet werden, treten Schwierigkeiten auf. Die Sensoren für Ammoniak erfordern einen protonierten Indikator. Bei Kombination mit einer hydrophoben Membran für die Detektion von Ammoniak produzieren polyanionische pH-Indikatoren, die die übliche Gruppe von protonierten Indikatoren darstellen und von der Art sind, wie sie in dem fluoreszierenden Harnstoffsensor, beschrieben in Rhines und Arnold (Anal. Chim. Acta, 231: 231 – 235 (1990)), verwendet wurden, keinen aktivierten und protonierten Fluorophor.
Auch wenn verschiedene Indikatoren für Harnstoff bekannt sind, so weisen viele Harnstoffsensoren Probleme mit Wechselwirkungen von pH- und CO₂-Effekten, eine niedrige Sensitivität, langsame Antwortzeiten und Reversibilität auf. Unter dem Gesichtspunkt der Herstellung wäre es folglich wünschenswert, einen preiswerten Sensor zu entwickeln, der zum Nachweis von Harnstoff geeignet ist, der eine hohe Empfindlichkeit und schnelle Reaktionszeit aufweist, und reversibel ist. Für den Sensor wäre es ferner von Vorteil, wenn er fähig wäre, zusammen mit Sensoren zu funktionieren, die andere Analyten nachweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Harnstoff-Sensormaterial (Harnstoff-Nachweismaterial) bereit, umfassend
eine erste Schicht, umfassend ein pH-empfindliches Fluorophor, das innerhalb eines ersten hydrophoben Polymers immobilisiert ist, wobei das Fluorophor innerhalb des ersten hydrophoben Polymers in Abwesenheit von Ammoniak protoniert ist, quantitativ mit Ammoniak reagieren kann und eine Übertragungsgruppe enthält, die neutral geladen ist, wenn sie in Gegenwart von Ammoniak deprotoniert ist, wobei die Konzentration an vorhandenem Ammoniak angezeigt wird durch eine Veränderung der Fluoreszenz, die direkt von der Deprotonierung des Fluorophors herrührt, und wobei die erste Schicht hergestellt worden ist durch Zusammenbringen des Fluorophors mit dem ersten hydrophoben Polymer in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels;
eine zweite Schicht, umfassend Urease und ein zweites Polymer; und
eine dritte Schicht, umfassend ein drittes Polymer.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Harnstoff in einer Lösung durch Messen der Ammoniak-Konzentration bereit, umfassend: Messen der Fluoreszenz des Sensormaterials nach der Erfindung, Exponieren des Sensormaterials gegenüber einer Lösung, die Harnstoff enthält, Messen der Fluoreszenz des Sensormaterials nach der Expositionsstufe, Bestimmen der Veränderung der Fluoreszenz und Bestimmen der Konzentration an Harnstoff in der Lösung.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Harnstoff-Sensormaterials bereit, umfassend:
Zusammenbringen eines ersten pH-empfindlichen Fluorophors mit einem ersten hydrophoben Polymer unter Bildung eines ersten Gemisches in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, wobei das Fluorophor innerhalb des ersten hydrophoben Polymers in Abwesenheit von Ammoniak protoniert ist und eine Übertragergruppe (transduzierende Einheit) enthält, die neutral geladen (nicht geladen) ist, wenn sie in Gegenwart von Ammoniak deprotoniert wird;
Bilden einer ersten Schicht aus dem ersten Gemisch auf einem Substrat;
Zusammenbringen von Urease mit einem zweiten Polymer unter Bildung eines zweiten Gemisches;
Bilden einer dritten Schicht aus einem dritten Polymer auf der zweiten Schicht.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine optische Sensorvorrichtung zum Bestimmen der Harnstoffkonzentration in einer Lösung, die Harnstoff enthält, durch Messen der Ammoniak-Konzentration bereit, umfassend:
eine optische Komponente, die für einfallende und austretende elektromagnetische Wellen durchlässig ist,
eine erste Schicht, die auf einer Oberfläche der optischen Komponenten abgelagert ist, wobei die erste Schicht ein pH-empfindliches Fluorophor umfasst, das in einem ersten hydrophoben Polymer immobilisiert ist, wobei das Fluorophor quantitativ mit Ammoniak reagieren kann und eine Übertragungseinheit (transduzierende Einheit) bildet, die neutral geladen (nicht geladen) ist, wenn sie in Gegenwart von Ammoniak deprotoniert ist, und wobei die erste Schicht hergestellt worden ist durch Zusammenbringen des Fluorophors mit dem ersten hydrophoben Polymer in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels,
eine zweite Schicht, umfassend Urease und ein zweites Polymer, die auf der ersten Schicht abgelagert ist, und
eine dritte Schicht, umfassend ein drittes Polymer, die auf der zweiten Schicht abgelagert ist,
wobei die optische Komponente mit Mitteln zur Aufnahme der Strahlungsemission optisch verbunden ist, um die Fluoreszenz zu messen, die ein Zeichen für die Ammoniak-Konzentration ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die folgenden Figuren sind Teil der vorliegenden Beschreibung und wurden eingeführt, um gewisse Aspekte der vorliegenden Erfindung darzustellen. Die vorliegende Erfindung kann unter Bezugnahme auf eine oder mehrere Figuren zusammen mit der ausführlichen Beschreibung bestimmter Ausführungsformen, die in der vorliegenden Beschreibung angegeben sind, besser verstanden werden.
Die 1 zeigt den Aufbau eines Harnstoff-Sensors.
Die 2 zeigt die Antwortkurve von drei Harnstoff-Sensoren in Einheiten der Fluoreszenzintensität vs. Konzentration (mM) von Harnstoff.
BESCHREIBUNG VON AUSGEWÄHLTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Sensor zum Nachweis von Harnstoff. Der Sensor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein Fluorophor, das in einem hydrophoben Polymer immobilisiert ist, wobei das Fluorophor quantitativ mit Ammoniak reagieren kann und wobei die Übertragereinheit des Fluorophors neutral geladen ist, wenn sie deprotoniert ist.
Die Übertragereinheit (transducing moiety) ist der Ring oder die Gruppe von Ringen in der Molekülstruktur des pH-empfindlichen Fluorophors, der bei Bestrahlung mit der besonderen Anregungsenergie, die für die Anregung erforderlich ist, die Fluoreszenz erzeugt. Dieses gleiche Segment des Moleküls erlebt aufgrund von Protonierung und Deprotonierung eine Resonanzveränderung, und diese Änderung führt zu einer Veränderung der Fluoreszenz, was es ermöglicht, die Fluoreszenz als Funktion der pH-Veränderung zu kalibrieren. Ein Substituentenring, der nicht an der pH-basierten Resonanzänderung beteiligt ist, kann negativ geladen sein, wenn er deprotoniert ist, siehe z. B. den Benzoesäurerest auf Rhodamin.
In der vorliegenden Erfindung hängt die Detektion von Harnstoff in einer Lösung vom Vorliegendes Enzyms Urease ab, das die Hydrolyse von Harnstoff zu NH₃ und CO₂ katalysiert. Die Sensoren gemäß der vorliegenden Erfindung detektieren Ammoniak, das produziert wird. Die Detektion von Ammoniak basiert auf Veränderungen des Fluoreszenzspektrums des Fluorophors bei der Deprotonierung, wie in der folgenden Reaktion gezeigt: INDH⁺ + NH₃ → IND + NH₄ ⁺
Das Sensormaterial umfasst drei Schichten: eine Übertragerschicht, eine Enzymschicht und eine Schutzschicht. Die Übertragerschicht (transducer layer) umfasst ein Fluorophor, das in einem hydrophoben Polymer immobilisiert ist. Die Enzymschicht umfasst das Enzym Urease, das in einem Polymer immobilisiert ist. Bei der dritten Schutzschicht handelt es sich um ein weiteres Polymer.
Die Fluorophore, die für die Sensoren gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind fluoreszierende pH-Indikatoren, die neutral geladen sind, wenn sie deprotoniert sind, und die in der Mikroumgebung des Polymers in protoniertem Zustand vorliegen. Solche Fluorophore umfassen Acridin-Orange:
und Rhodamin-Farbstoffe:
worin R¹ und R² unabhängig voneinander für ein Alkyl mit zwischen etwa 2 und 20 Kohlenstoffatomen stehen und R³ für Wasserstoff oder ein Alkyl mit zwischen etwa 2 und 20 Kohlenstoffatomen steht. Acridin-Orange und Rhodamin-Farbstoffe sind bevorzugte Fluorophore. Die Modulation der Acridin-Fluroeszenz wird im allgemeinen mit einer Anregung bei 489 nm und einer Emission bei 540 nm gemessen, kann jedoch auch bei anderen Wellenlängen angeregt werden. Eine ratiometrische Ablesung kann erzielt werden, indem bei 2 Wellenlängen angeregt wird und ein Verhältnis der beiden Emissionen als Funktion von Ammoniak erzeugt wird. Die Modulation der Fluoreszenz eines Rhodamin-Derivates, worin R¹ und R² beide für C₁₈H₃₇ stehen, wird im allgemeinen mit einer Anregung bei 530 nm und einer Emission bei 590 nm gemessen.
Bei den hydrophoben Polymeren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, handelt es sich vorzugsweise um Polymere, in denen das Fluorophor zumindest teilweise löslich ist. Solche Polymere umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Polystyrol, Polyurethan, Poly(ethylcellulose), Polydiene wie z. B. Poly(1,3-butadien), Butadien-Acrylonitril-Copolymer, Poly(dimethylbutadien) und Polyisopren, Polyalkane wie z. B. Polyethylen, Isobutan-Isopren-Copolymer, Poly(4-methylpenten), Polypropylen, Polyethylmethacrylat, Polytetrafluorethylen, Poly(vinylalkohol), Poly(vinylchlorid) und Polyoxymethylen, Cellulose und Cellulosederivate wie z. B. Cellulose-hydrat, Celluloseacetat, Cellulosenitrat, Ethylcellulose und Celluloseethylmethacrylat, Polymethacrylate wie z. B. Poly(methylmethacrylat) und Poly(ethylmethacrylat) wie auch Polysiloxane, Polyester und Polycarbonate. Ein bevorzugtes Polymer ist Ethylcellulose. Diese hydrophoben Polymere können sowohl in der Übertragungsschicht als auch in der Schutzschicht der bevorzugten Ausführungsform verwendet werden.
Das Fluorophor und das hydrophobe Polymer werden kombiniert, um ein fluoreszierendes Polymer zu ergeben. Die Signalintensitäten des fluoreszierenden Polymers sind hoch, da der Farbstoff in dem organischen Medium des Polymers sehr gut löslich ist, und kein Quenchen der Fluoreszenz auftritt (wie im U.S. Patent Nr. 5,506,148), aufgrund des Fehlens von negativen Ladungen auf dem Farbstoffmolekül. Bei Aussetzung gegenüber Ammoniak nimmt die Fluoreszenz des fluoreszierenden Polymers ab, in Übereinstimmung mit der Deprotonierung des Farbstoffs bei Bildung von Ammonium-Ionen in dem fluoreszierenden Polymer. Diese Sensorantwort ist reversibel, wenn die Ammoniakquelle entfernt wird und das Ammoniak im Sensor aus der Membran diffundiert.
Zu dem fluoreszierenden Polymer kann gegebenenfalls eine Onium-Verbindung zugegeben werden. Die Onium-Verbindung stellt den Mikroumgebungs-pH des fluoreszierenden Polymers ein, um die Sensitivität gegenüber Ammoniak zu verstärken. Onium-Verbindungen umfassen Ammonium-, Phosphonium- und Pyridinium-Verbindungen. Beispiele für geeignete Onium-Verbindungen umfassen Tetrabutylammoniumhydroxid, Tetrabutylammoniumchlorid, Cetyltrimethylammoniumbromid, Tetrabutylammoniumwasserstoffsulfat, Tetrabutylammoniumtrifluormethan, Tetrabutylammoniumacetat, Tetraethylammoniumbromid, Tetraethylammonium-p-toluolsulphat, Phenyltrimethylammoniumchlorid, Benzyltrimethylammoniumbromid, Tetra-n-propylammoniumbromid, Benzyltriethylammoniumtetrafluorborat, n-Dodecyltrimethylammoniumbromid, Tetraphenylphosphoniumchlorid, n-Hexadecylpyridiniumbromid, Triphenylphosphoniumchlorid, Tetrabutylphosphoniumbromid und Hexadecyltrimethylammoniumhydroxid. Bevorzugte Onium-Verbindungen sind quaternäre Ammonium-Verbindungen, wie beispielsweise Tetrabutylammoniumhydroxid.
Das Sensormaterial kann hergestellt werden, indem das Fluorophor und das Polymer in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden, wie beispielsweise einem Alkohol, Toluol, Tetrahydrofuran oder ein anderes organisches Lösungsmittel, das aus dem Stand der Technik zum Lösen des hydrophoben Polymers bekannt ist. Im allgemeinen liegt die Menge an zu verwendendem Fluorophor bei zwischen etwa 0,05 % und 0,5 % des Gesamtgewichts. Der Fluorophor wird gleichmäßig innerhalb des resultierenden fluoreszierenden Polymers verteilt.
Eine Membran oder ein Film kann anschließend aus dem gelösten fluoreszierenden Polymer nach einem beliebigen im Stand der Technik bekannten Verfahren gebildet werden, wie beispielsweise Spincoaten oder Streichen auf ein nicht-reaktives Substrat wie z. B. Glas, Kunststoff oder Keramik. Alternativ dazu kann das Fluorophor kovalent an das Polymer gebunden werden, wie im U.S. Patent Nr. 5,005,572 beschrieben.
Die Enzymschicht besteht aus dem Enzym Urease, das in einem hydrophilen oder hydrophoben Polymer gelöst ist, und anschließend auf die Übertragungsschicht aufgetragen wird. Die Enzymschicht kann auf der Übertragungsschicht ähnlich wie die Ablagerung der Übertragungsschicht auf dem Substrat abgelagert werden. Das Polymer kann quervernetzt werden und das Enzym kann für eine Verknüpfung an das Polymer chemisch modifiziert werden. Polymere, die für die Enzymschicht geeignet sind, umfassen Polyvinylalkohol, Polyhydroxybutylacrylat, Hydroxypropylcellulose, Acrylamidderivate und weitere hydrophile und hydrophobe Polymere, die dem Fachmann bekannt sind.
Die Schutzschicht umfasst ein Polymer, das gegenüber dem Analyten durchlässig ist, jedoch nicht leicht in der Probenmatrix löslich ist. Das Polymer kann in einem Lösungsmittel aufgelöst werden, das anschließend auf die Enzymschicht in ähnlicher Art und Weise aufgetragen wird. Polymere, die für eine Anwendung in der Schutzschicht geeignet sind, sind in der Regel die vorstehend beschriebenen Polymere, vorzugsweise Polyhydroxyethylmethacrylat (polyHEMA). Dieses Polymer wird als Schutzbeschichtung aufgetragen, um zu verhindern, dass das Enzym sich unmittelbar in die Probe löst.
Die fluoreszierenden Polymere können auch als Übertragerbeschichtungen für optische Sensoren verwendet werden. Traditionelle optische Sensoren für CO₂, NH₃ und weitere Spezies, die mittels einem pH-modulierten Übertrager detektiert werden, basieren auf dem Severinghaus-Modell (Severinghaus, J.W.; Bradley, A.F.J. Appl. Physiol., 13: 515 (1958)), bei welchem eine Übertragungsschicht vorliegt, die ein pH-sensitives Fluorophor oder Chromophor enthält, beschichtet mit einem hydrophoben Überzugsmembranmaterial, wie beispielsweise einem Polymer auf Siloxanbasis (Munkholm, C., Walt, D.R., Milanovich, F.P., Talanta, 35: 109 – 112 (1988)). Eine inhärente Schwierigkeit bei Severinghaus-Sensoren ist deren Fehlerpotential aufgrund von sehr kleinen Lecklöchern (pinhole leaks) in der Überzugsmembran.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Sensoren werden quantitative Messungen des Ammoniakgehalts über eine Modulation der Mikroumgebung des Fluorophors bereitstellen. Da diese Sensor-Mikroumgebungen innerhalb des Polymers verstreut sind, erfordert die Herstellung solch eines Sensors nur eine einzige Anwendung des Membranmaterials, und diese einzige Membrankonfiguration führt dazu, dass das Problem von Lecklöchern irrelevant wird. Die Sensoren sprechen nicht auf Veränderungen des Massen-pH (bulk pH) an, was darauf hindeutet, dass die Übertrager-Mikrodomänen von der Probe aufgefangen werden. Dieser Sensor kann in einem System eingesetzt werden, dass die reflektierte Oberflächenfluoreszenz misst, wie auch in einem System, das ein evaneszentes Wellensignal misst.
Ein Vorteil der optischen Sensoren liegt in ihrer Fähigkeit, Informationen aus unterschiedlichen Analyten über ihre diskreten Wellenbereiche aufzulösen. Auf diese Art könnte man einen Ammoniak-Sensor mit einem Sensor für einen anderen Analyten in der gleichen Membran verbinden, jedoch die Ableseinformation bei verschiedenen Wellenlängen sammeln. Die Sensor-Mikrodomänen würden mit mehreren Übertragern besetzt sein, jedoch würde die Chemie und die Signalverarbeitung stattfinden, als ob die Sensoren in getrennten Schichten angeordnet wären. In solch einem Mehr-Analyten-Sensor kann es sich bei dem Übertrager für den Nicht-Ammoniak-Analyten um einen polyanionischen Farbstoff handeln, wie beispielsweise jene, die im U.S. Patent Nr. 5,506,148 beschrieben sind.
Das Sensormaterial kann als Beschichtung auf einer beliebigen Oberfläche verwendet werden, und kann zur Messung von Harnstoff in einer beliebigen Lösung wie beispielsweise in Blut, Speichel oder Urin eingesetzt werden. Es kann Teil von Produkten und Systemen sein, die bei der Messung von kritischen Blutanalyten, in Anwendungen zur Überwachung der Dialyse und in sämtlichen klinischen Pflegegeräten, die zur Überwachung von Harnstoff verwendet werden, eingesetzt werden. Es ist denkbar, dass dieses Sensormaterial in akademischen Forschungsprojekten verwendet wird, da es an eine Vielzahl von Messsystemen angepasst werden kann, beispielsweise optischen Fasern.
Bei Verwendung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können extrem dünne Sensorfilme hergestellt werden, ungefähr 0,5 bis 5 μm dick, mit einem detektierbaren Fluoreszenzlevel. Solche dünnen Filme können ungewöhnlich schnelle Antwortzeiten ergeben und können ideal sein zum Beschichten von planaren Sensoren, die in Methoden zur Detektion von evaneszenten Wellen verwendet werden, worin die fluoreszierende Beschichtung innerhalb der gleichen Dimensionen wie die propagierende Welle sein soll. Sensoren, die nach dieser Methode hergestellt sind, werden nicht durch Lecklöcher beeinträchtigt, da das Sensormaterial in der Beschichtung kontinuierlich ist. Diese Sensorfilme können auch aufgrund des Fehlens einer wässrigen Schicht, die gegenüber einer Dehydratation empfindlich sein kann, eine längere Lebensdauer aufweisen.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darzustellen. Für den Fachmann ist es selbstverständlich, dass die Techniken, die in den folgenden Beispielen offenbart sind, Techniken darstellen, die vom Erfinder als bei der Durchführung der Erfindung gut funktionierende Techniken aufgefunden wurden, und die somit als bevorzugte Ausführungsformen gelten können.
Beispiel 1
Der Farbstoff Acridin-Orange wurde zu einer 10 %-igen Lösung von Ethylcellulose zugegeben, um 5 × 10^–4 M zu ergeben. Tetrabutylammoniumhydroxid wurde zugegeben, um eine Endlösung von 0,0045 M zu ergeben. Die Lösung wurde Ultraschallbehandelt, bis das Vermischen vollständig war. Sie wurde anschließend auf ein Glassubstrat spingecoated und bei Raumbedingungen für 24 Stunden gehärtet. Eine 5 %-ige Lösung von Polyvinylalkohol in deionisiertem Wasser wurde hergestellt, unter Verwendung von Polyvinylalkohol mit einem Molekulargewicht (molecular weight, M.W.) von 124.000 bis 186.000. Die Enzymbeschichtung wurde hergestellt, indem 90 mg Urease (Sigma, U 4002, Aktivität: 50.000 – 100.000 Einheiten/g) zu 1,5 ml Polyvinylalkohol gegeben wurde, und anschließend auf die Ethylcelluloseschicht durch Spincoaten aufgetragen. Eine dritte Schicht aus polyHEMA (10 % in Methanol) wurde auf die Enzymschicht mittels Spincoaten aufgetragen. Der Sensor wurde bei Raumbedingungen für 24 Stunden gehärtet. Er wurde anschließend mit einem kommerziellen Fluorimeter getestet, ausgestattet mit einer Haltevorrichtung für den Sensor, unter Verwendung von Lösungen von frisch hergestelltem Harnstoff in Phosphatpuffer (0,05 M, pH 7,8). Die 1 zeigt den Sensoraufbau. Die 2 zeigt die Antwortkurve von 3 Harnstoffsensoren in Einheiten von Fluoreszenzintensität vs. Konzentration (mM) Harnstoff. Das Signal verringerte sich mit der Zunahme der Konzentration an Harnstoff, was mit der Deprotonierung des Fluorophors Acridin-Orange durch die Produktion von Ammoniak aus der Enzym-katalysierten Hydrolyse von Harnstoff im Einklang steht.
Beispiel 2
Ein Sensor wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, außer dass keine Schutzbeschichtung aus polyHEMA als dritte Beschichtung zugegeben wurde. Der Sensor zeigte eine Antwort gegenüber Harnstoff, verlor jedoch kontinuierlich an Harnstoffantwort aufgrund von Lecken der Enzymschicht.
Beispiel 3
Eine Enzymlösung wurde durch Zugabe von 10 mg Urease (die gleiche wie vorstehend angegeben) zu 200 μl Polyhydroxybutylacrylat (27 % in Isopropanol) hergestellt. Die Lösung wurde auf die Übertragungsschicht, hergestellt mit Ethylcellulose, Acridin-Orange und Tetrabutylammoniumhydroxid (die gleiche wie vorstehend angegeben) spingecoated. Der Sensor wurde bei Raumbedingungen für 24 Stunden gehärtet und anschließend im Hinblick auf die Harnstoffantwort untersucht. Er sprach auf Harnstoffkonzentrationen von 5, 10, 20, 50 und 100 mM an, hergestellt in 0,05 M Tris-Puffer, pH 8,0.
Beispiel 4
Polyhydroxymethylmethacrylat (polyHEMA) wurde in Methanol gelöst, um eine 10 %-ige Lösung zu ergeben. Die Urease wurde in Puffer gelöst, 100 mg in 1 ml 0,05 M Tris-Puffer, pH 8,0. Drei Konzentrationen von Urease in polyHEMA wurden hergestellt, und jede wurde auf einen Übertrager, hergestellt mit Ethylcellulose, Acridin-Orange und Tetrabutylammoniumhydroxid, spingecoated. Der Sensor wurde bei Raumbedingungen für 24 Stunden gehärtet und anschließend im Hinblick auf die Harnstoffreaktion getestet, wie vorstehend angegeben. Der Sensor zeigte eine Reaktion gegenüber Harnstoff, war jedoch langsam beim Antworten und unterlag Abweichungen.
Beispiel 5
Hydroxypropylcellulose wurde als eine 25 %-ige Lösung in wässrigem Puffer, pH 8, hergestellt. 10 mg Urease hoher Aktivität (Sigma, U 0251, Aktivität: 600.000 – 1.200.000 Einheiten/g) wurde zu 250 μl Polymerlösung zugegeben und auf einen Übertrager spingecoated, hergestellt mit Ethylcellulose, Acridin-Orange und Tetrabutylammoniumhydroxid. Eine Abdeckbeschichtung von 5 % Acrylamid in Methanol wurde auf die Enzymschicht spingecoatet. Der Sensor zeigte eine reversible Antwort gegenüber 100 mM Harnstoff, und wurde nicht im Hinblick auf die niedrigeren Konzentrationen getestet.
Beispiel 6
Urease wurde nach dem Verfahren von Narinesingh et al. (Anal. Chim. Acta 249: 387 – 393 (1991)) kovalent an Polyvinylalkohol gekoppelt. Zur Herstellung eines Sensors wurden 0,16 g des Enzympolymers in 1 ml 0,05 M NaHCO₃, pH 8,0, gelöst, und auf einen Übertrager spingecoatet, hergestellt aus Ethylcellulose, Acridin-Orange und Tetrabutylammoniumhydroxid. Der Sensor zeigte eine Antwort gegenüber 100 mM Harnstoff, die reversibel war, und zeigte eine verbesserte Erholung gegenüber den Sensoren, die ohne die kovalente Bindung des Enzyms hergestellt wurden.
Beispiel 7
Ein Acrylamid-Derivat (15 g), synthetisiert von Joseph Berger, Ciba-Geigy, Basel, Schweiz (JB 2701155), wurde in Methanol gelöst (100 ml). Urease wurde in Tris-Puffer gelöst (100 mg in 1 ml). Die Enzymlösung wurde in der Polymerlösung in verschiedenen Konzentrationen gelöst. Die Sensoren wurden durch Spincoaten der Polymerlösungen auf die Übertrager, hergestellt aus Ethylcellulose, Acridin-Orange und Tetrabutylammoniumhydroxid, hergestellt. Die Hälfte der Sensoren wurden ferner mit polyHEMA beschichtet. Alle Sensoren wurden mit Harnstofflösungen getestet, im Konzentrationsbereich von 2 – 5 mm. Die Sensoren sprachen auf alle Harnstofflevels an, mit und ohne polyHEMA-Beschichtung.
Beispiel 8
Es wurde die gleiche Herstellung wie in Beispiel 1 wiederholt, wobei das Enzym mit Standardaktivität (U 4002) durch die Urease mit hoher Aktivität (Sigma U 0251) ersetzt wurde, und diese Herstellung führte zu einem Sensor mit einer starken Harnstoffreaktion, sowohl im Hinblick auf die Antwortzeit bis Gleichgewicht als auch die Stärke der Reaktion gegenüber Harnstoff.
Vergleichsbeispiel 1
Die Herstellung wie in Beispiel 5 wurde wiederholt, außer dass keine Abdeckbeschichtung verwendet wurde. Der Sensor sprach nicht auf Harnstoff an.
Vergleichsbeispiel 2
Die Herstellung gemäß Anspruch 1 wurde wiederholt, unter Austausch mit einem Polyvinylalkohol mit einem M. W. von 11.000. Nach einer anfänglichen starken Abnahme des Signals bei der Aussetzung gegenüber der Probe zeigte der Sensor anschließend geringe Reaktion gegenüber Harnstoff. Dieses wurde in mehreren Herstellungen bestätigt. Durch Ersetzen des Polyvinylalkohols mit niedrigem Molekulargewicht durch das Polymer mit einem M. W. von 124.000 wurde eine Antwort gegenüber Harnstoff erhalten.
Alle in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und Methoden können im Lichte der vorliegenden Offenbarung ohne unzumutbaren Aufwand hergestellt und durchgeführt werden. Auch wenn die Zusammensetzungen und Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden sind, ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass die Zusammensetzungen und Methoden sowie die Schritte oder die Reihenfolge der Schritte der Methode, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben sind, variiert werden können, in Übereinstimmung mit der beanspruchten Erfindung. Insbesondere ist es offensichtlich, dass die spezifisch in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Mittel durch andere chemisch verwandte Mittel ersetzt werden können, während gleiche oder ähnliche Ergebnisse erzielt werden würden, in Übereinstimmung mit der Erfindung, wie sie in den folgenden Ansprüchen definiert wird.

Claims

Harnstoff-Sensormaterial, umfassend eine erste Schicht, umfassend ein pH-empfindliches Fluorophor, das innerhalb eines ersten hydrophoben Polymers immobilisiert ist, wobei das Fluorophor innerhalb des ersten hydrophoben Polymers in Abwesenheit von Ammoniak protoniert ist, quantitativ mit Ammoniak reagieren kann und eine Übertragereinheit (transduzierende Einheit) enthält, die neutral geladen ist, wenn sie in Gegenwart von Ammoniak deprotoniert wird, wobei die Konzentration an vorhandenem Ammoniak angezeigt wird durch eine Veränderung der Fluoreszenz, die direkt von der Deprotonierung des Fluorophors herrührt, und wobei die erste Schicht hergestellt worden ist durch Zusammenbringen des Fluorophors mit dem ersten hydrophoben Polymer in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels; eine zweite Schicht, umfassend Urease und ein zweites Polymer und eine dritte Schicht, umfassend ein drittes Polymer.
Sensormaterial nach Anspruch 1, wobei die erste Schicht zusätzlich eine Onium-Verbindung umfasst.
Sensormaterial nach Anspruch 2, wobei die Onium-Verbindung eine quaternäre Ammonium-Verbindung ist.
Sensormaterial nach Anspruch 3, wobei die Onium-Verbindung Tetrabutylammoniumhydroxid ist.
Sensormaterial nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fluorophor Acridin-Orange ist.
Sensormaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fluorophor ein Rhodamin-Farbstoff ist.
Sensormaterial nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das erste hydrophobe Polymer Ethylcellulose ist.
Sensormaterial nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Polymer der zweiten Schicht Polyvinylalkohol ist.
Sensormaterial nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das dritte Polymer Polyhydroxyethylmethacrylat ist.
Verfahren zur Herstellung eines Harnstoff-Sensormaterials, umfassend Zusammenbringen eines pH-empfindlichen Fluorophors mit einem ersten hydrophoben Polymer unter Bildung eines ersten Gemisches in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, wobei das Fluorophor innerhalb des ersten hydrophoben Polymers in Abwesenheit von Ammoniak protoniert ist und eine Übertragereinheit enthält, die neutral geladen ist, wenn sie in Gegenwart von Ammoniak deprotoniert wird; Bilden einer ersten Schicht aus dem ersten Gemisch auf einem Substrat; Zusammenbringen von Urease mit einem zweiten Polymer unter Bildung eines zweiten Gemisches; Bilden einer zweiten Schicht aus dem zweiten Gemisch auf der ersten Schicht und Bilden einer dritten Schicht aus einem dritten Polymer auf der zweiten Schicht.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Fluorophor Acridin-Orange ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Fluorophor ein Rhodamin-Farbstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, wobei das erste hydrophobe Polymer Ethylcellulose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Polymer der zweiten Schicht Polyvinylalkohol ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei das dritte Polymer der dritten Schicht Polyhydroxyethylmethacrylat ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei das Substrat Glas, Kunststoff oder Keramik ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei das erste Gemisch eine Onium-Verbindung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Onium-Verbindung eine quaternäre Ammonium-Verbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Onium-Verbindung Tetrabutylammoniumhydroxid ist.
Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Harnstoff in einer Lösung durch Messen der Ammoniak-Konzentration, umfassend: Messen der Fluoreszenz des Sensormaterials nach einem der Ansprüche 1 bis 9, Exponieren des Sensormaterials gegenüber einer Lösung, die Harnstoff enthält, Messen der Fluoreszenz des Sensormaterials nach der Expositionsstufe, Bestimmen der Veränderung der Fluoreszenz und Bestimmen der Konzentration an Harnstoff in der Lösung.
Optische Messvorrichtung zum Bestimmen der Konzentration von Harnstoff in einer Harnstoff enthaltenden Lösung, durch Messen der Ammoniak-Konzentration, umfassend: eine optische Komponente, die für einfallende und austretende elektromagnetische Wellen durchlässig ist, eine erste Schicht, die auf einer Oberfläche der optischen Komponenten abgelagert ist, wobei die erste Schicht ein pH-empfindliches Fluorophor umfasst, das in einem ersten hydrophoben Polymer immobilisiert ist, wobei das Fluorophor quantitativ mit Ammoniak reagieren kann und eine Übertragereinheit bildet, die neutral geladen ist, wenn sie in Gegenwart von Ammoniak deprotoniert ist, und wobei die erste Schicht hergestellt worden ist durch Zusammenbringen des Fluorophors mit dem ersten hydrophoben Polymer in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, eine zweiten Schicht, umfassend Urease und ein zweites Polymer, die auf der ersten Schicht abgelagert ist, und eine dritte Schicht, umfassend ein drittes Polymer, die auf der zweiten Schicht abgelagert ist, wobei die optische Komponente mit Mitteln zur Aufnahme der Strahlungsemission optisch verbunden ist, um die Fluoreszenz zu messen, die ein Zeichen für die Ammoniak-Konzentration ist.
Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei das Fluorophor Acridin-Orange ist.
Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei das Fluorophor ein Rhodamin-Farbstoff ist.
Vorrichtung nach Anspruch 21, 22 oder 23, wobei das erste hydrophobe Polymer Ethylcellulose ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei das Polymer der zweiten Schicht Polyvinylalkohol ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei das dritte Polymer Polyhydroxyethylmethacrylat ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei die optische Komponente eine optische Faser ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei die optische Komponente ein ebener Wellenleiter ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei die optische Komponente ein evaneszenter Wellensensor ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 29, umfassend ferner einen oder mehrere Sensoren, die andere Analyte als Ammoniak nachweisen können.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 30, wobei die erste Schicht zusätzlich eine Onium-Verbindung enthält.