DE60029528T2

DE60029528T2 - Trennungsverfahren von Substanzen durch Dielektrophoresis

Info

Publication number: DE60029528T2
Application number: DE60029528T
Authority: DE
Inventors: Masao Sakyo-ku Washizu; Ltd. Tomohisa c/o Wako Pure Chem. Ind. Kawabata
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 2000-09-28
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2020-09-29
Also published as: KR100507454B1; KR100564724B1; KR20050047516A; US7198702B1; EP1088592B1; KR20010050778A; ATE333943T1; EP1088592A2; EP1614477A1; EP1088592A3; ES2269054T3; TW526095B; DE60029528D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Trennen von zwei oder mehreren Arten von Molekülen unter Verwendung von dielektrophoretischen Kräften.
Hintergrund der Erfindung
In letzter Zeit hat der Fortschritt in der Halbleiter-Technik die Verarbeitungstechnik von Materialien in Größenordnungen von Nanometern bis Mikrometern mittels der Feinstzerspannungs-Technik, wie beispielsweise Photolithographie, etabliert, welche fortschreitet, um auch Fortschritte zum gegenwärtigen Zeitpunkt zu machen.
Auf den Gebieten der Chemie und der Biochemie wächst eine neue Technologie, genannt Micro-Total-Analyse-System (μ-TAS) – Labor auf einem Chip – bei der eine derartige Feinstzerspanungs-Technik eingesetzt wird, um eine ganze Serie von chemischen/biochemischen Analyseschritten der Extraktion von Komponente(n), welche von biologischen Proben analysiert werden sollen (Extraktionsschritt), des Analysierens der Komponente(n) mit chemischen/biochemischen Reaktion(en) (Analyseschritt) und der nachfolgenden Trennung (Trennungsschritt) und Detektion (Detektionsschritt), auszuführen, unter Verwendung einer sehr kleinen Analysevorrichtung integriert auf einem Chip, bei dem jede Seite von ein paar Zentimetern bis ein paar Dezimetern lang ist.
Von den Verfahren des μ-TAS wird erwartet, einen großen Beitrag zum Sparen der Analysezeit beizutragen, die zu verwendenden Mengen an Proben und Reagenzien für die chemischen/biochemischen Reaktionen zu reduzieren und die Größe der Analyseinstrumente und den Platz für die Analyse im Rahmen aller chemischen/biochemischen Analyseschritten zu reduzieren.
Insbesondere für den Trennungsschritt in μ-TAS wurden elektrophoretische Verfahren entwickelt, bei denen eine Kapillare (feines Röhrchen) mit einem Innendurchmesser von weniger als 1 mm, welche aus Teflon, Siliziumdioxid oder ähnlichem gemacht ist, als die Separationskolonne verwendet wird, um eine Trennung mit Chargenunterschieden von Substanzen unter einem hochelektrischen Feld zu erreichen, und Kapillar-Kolonnen-Chromatographieverfahren, bei denen eine ähnliche Kapillare verwendet wird, um eine Trennung mit dem Unterschied der Interaktion zwischen Carrier im Kolonnenmedium und Substanzen zu erreichen.
Allerdings benötigen kapillar-elektrophoretische Methoden eine Hochspannung zur Trennung und bergen das Problem einer niedrigen Sensitivität der Detektion wegen einem begrenzten Kapillarvolumen in der Detektionszone, wobei dies ein derartiges Problem darstellt, dass sie nicht zur Trennung von Substanzen mit hohem Molekulargewicht geeignet sind, jedoch geeignet zur Trennung von Substanzen mit niederem Molekulargewicht, da die Länge der Kapillare zur Trennung auf dem Kapillar-Chip auf dem Chip limitiert ist. Dadurch kann eine Kapillare nicht mit der nötigen Länge zur Trennung von Substanzen mit hochmolekularem Gewicht hergestellt werden. Ferner existiert bei Kapillar-Kolonnen-Chromatographie-Methoden die Einschränkung den Durchsatz des Trennungsverfahrens zu steigern, wobei dies ein solches Problem ist, dass die Reduzierung der Verarbeitungszeit schwierig ist.
Daher sind Trennungsverfahren als Mittel, um die oben beschriebenen Probleme zu lösen, nun erkannt worden unter Ausnutzung des Phänomens, bei denen das Platzieren der Substanzen unter einem ungleichförmigen elektrischen Feld zu der positiven und negativen Polarisation innerhalb der Substanz führt, wobei eine Antriebskraft zum Bewegen der Substanzen bereitgestellt wird, eine so genannte dielektrophoretische Kraft [H. A. Pohl, „Dielectrophoresis", Cambridge Univ. Press (1978); T. B. Jones, „Electromechanics of Particles", Cambridge Univ. Press (1995), und ähnliches].
Von diesen Trennungsmethoden wird derzeit angenommen, dass sie aufgrund der folgenden Punkte die geeignetsten Trennungsverfahren bei μ-TAS sind: (1) eine schnelle Trennung kann bei niedriger Spannung ohne Benötigung einer hohen Spannung wie bei der Kapillar-Elektrophorese erwartet werden, da ein elektrisches Feld und sein Gradient bis zu einem extremen Ausmaß erhöht werden kann, wenn Elektroden aus dem Micromachinig eingesetzt werden, da der Grad der Dielektrophorese-Kräfte von der Größe und den dielektrischen Eigenschaften von Substanzen (Partikeln) abhängt und proportional zum elektrischen Feld-Gradienten ist; (2) ein Anstieg der Temperatur kann wegen des Einsatzes des elektrischen Feldes minimiert werden und ein hoch-elektrisches Feld kann gebildet werden, da eine Zone eines starken elektrischen Feldes bei einer äußerst kleinen Region lokalisiert ist; (3) da die dielektrophoretische Kraft eine Kraft ist, die proportional zu dem elektrischen Feld-Gradienten ist, wird die Kraft als unabhängig von der Polarität der angelegten Spannung verstanden und funktioniert daher unter einem elektrischen Wechselstrom-Feld ähnlich einem elektrischen Gleichstrom-Feld, und wenn daher ein Wechselstrom mit hoher Frequenz eingesetzt wird, kann eine Elektrodenreaktion (elektrolytische Reaktion) in einer wässrigen Lösung unterdrückt werden, so dass die Elektroden selbst in den Kanal (Probenflusspfad) integriert werden können; (4) ein Verbessern der Detektionssensitivität kann daher erwartet werden, da keine Einschränkung eines Kammervolumens der Detektionskomponente wie bei der kapillaren Elektrophorese und ähnlichem auftritt.
Als Trennungsmethoden unter Ausnutzung von dielektrophoretischen Kräften wie oben beschrieben, wurden bis zum jetzigen Zeitpunkt verschiedene Verfahren vorgestellt [M. Washizu, et. al., IEEE Transaction IA, vol. 30, No. 4 S. 835–843 (994); M. Washizu, et. al., Conf. Rec. The Institute of Electrostatics Japan, '93 Ann. Meet. (Int'I Session), S. 27,32 (1993); Y. Huang, et al., Biophys. J., vol. 73, S. 1118–1129 (1997); und N. G. Green et al., J. Phys. D.: Appl. Phys. Vol. 31, 25–30 (1998), und ähnliche].
Zum Beispiel beschreibt Journal of Physics D, British Journal of Applied Physics (J. Phys. D: Appl. Phys), 27, 2659–2662 (1994), dass von Suspensionen, enthaltend HL-60-Zellen und normale Blutzellen, entsprechende Zellen getrennt werden können; Microbiology, 140, 595–591 (1994) beschreibt, dass von Suspensionen, enthaltend unterschiedliche Mikroorganismen, die Mikroorganismen in verschiedene Arten von Hefe und Bakterien voneinander getrennt werden können; das Journal of Biotechnology, 32, 29–37 (994) beschreibt, dass von Suspensionen enthaltend lebende und tote Zellen von Hefe, beide Zellen voneinander getrennt werden können; und J. Phys. D: Appl. Phys, 31, 25–30 (1998) beschreibt, dass von Suspensionen, enthaltend Latex-Partikel mit einem Durchmesser von 93 nm und 216 nm, beide Partikel durch Dielektrophorese und Elektrofluid-Kräfte voneinander getrennt werden können.
Ferner berichtete M. Washizu, et al., IEEE Transaction IA, vol. 30, Nr. 4, S. 835–843 (1994), dass unter Verwendung einer Lösung, enthaltend eine einzelne biologische Komponente als Proben, beispielsweise die Komponente Avidin (68 kDa), Concanavalin A (52 kDa), Chymotrypsinogen A (25 kDa) oder Ribonuklease A (13,7 kDa) an der Elektrode durch dielektrophoretische Kräfte gefangen wird, und ebenso unter Verwendung von Lösungen, enthaltend eine einzelne biologische Komponente als Proben, die Komponente auf der Elektrode durch dielektrophoretische Kräfte gefangen werden kann [die Fangrate war 100% unter Verwendung einer Probe von 48,5 kb DNA alleine, ca. 60% unter Verwendung einer Probe von 15 kb DNA alleine, ca. 50% unter Verwendung einer Probe von 9 kb ringförmiger DNA alleine und wenige % unter Verwendung einer Probe von Avidin (68 kDa) alleine].
Allerdings sind Berichte von Trennungsmethoden mit konvetionellen dielektrophoretischen Kräften wie oben beschrieben, beschränkt auf das Trennen von Partikeln mit einer niedrigen Löslichkeit in einer Lösung im Vergleich mit DNAs und Proteinen, wie beispielsweise verschiedene Zellen und Latex-Partikel, oder andererseits nur auf das Einfangen einer einzelnen (eine Art von) DNA oder Protein, und kein Report wurde bislang auf das Trennen von respektiven Molekülen aus Lösungen, in denen zwei oder mehrere Arten von biologischen Komponenten Molekülen gelöst sind, wie beispielsweise DNAs und Proteine, gerichtet.
Dies ist so, weil zwei oder mehrere Arten von Molekülen, wie beispielsweise Proteine und DNAs, die im Vergleich mit Zellen und Latex-Partikeln eine sehr kleine physikalische Größe aufweisen, eingestuft werden, schwierig in der Trennung voneinander in einer Lösung zu sein, in der diese Moleküle gelöst sind, auf der Basis des Unterschieds zwischen der Größe der jeweiligen Moleküle unter Verwendung von dielektrophoretischen Kräften, da die Stärke der dielektrophoretischen Kräfte abhängt von der physikalischen Größe der Substanzen, so dass die Substanzen mit einem größeren Volumen eine größere dielektrophoretische Kraft empfangen, und auch weil konventionelle Trennung bei einer schwachen elektrischen Feldstärke von weniger als 500 KV/m durchgeführt worden ist, wobei die Trennung nicht erreichbar ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Das Dokument EP-A-0 815 942 offenbart ein Trennungsverfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Trennen von zwei oder mehr Arten von Molekülen voneinander bereitzustellen unter Verwendung von dielektrophoretischen Kräften. Diese Ziele werden mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1 erreicht.
Es ist ebenso ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Trennen von zwei oder mehr Arten von Molekülen voneinander bereitzustellen, welche in einer Lösung gelöst sind, unter Verwendung von dielektrophoretischen Kräften, wobei eine solche Trennung bisher unmöglich war.
Ferner ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, welches geeignet ist, betreffende Moleküle schnell und einfach aus einer Lösung zu trennen, in welcher zwei oder mehrere Arten von Molekülen gelöst sind, beispielsweise Biomoleküle, wie beispielsweise DNAs und Proteine, wobei eine solche Trennung bisher durch dielektrophoretische Kräfte unmöglich war.
Die vorliegende Erfindung wird durchgeführt zum Zwecke der Lösung der oben genannten Probleme und hat zum ersten Mal die erfolgreiche Trennung von zwei oder mehreren Arten von Molekülen erreicht, wobei eine solche Trennung bisher unter Verwendung von dielektrophoretischen Kräften mittels zwei Arten von Verfahren, welche unten beschrieben sind, unmöglich war.
Das erste Verfahren umfasst das Bilden einer komplexen Substanz eines „spezifischen Moleküls" in einer Probe und einer „Substanz, welche geeignet ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des 'spezifischen Moleküls', welches an dem darin enthaltenen 'spezifischen Molekül' bindet, zu ändern, und dadurch das Trennen der komplexen Substanz von den anderen Molekülen außer den spezifischen Molekülen in der Probe. Bei bisher bekannten Trennungsverfahren mit dielektrophoretischen Kräften wurde die Trennung nicht durch das Bilden solch einer komplexen Substanz gefördert und eine solche Idee wurde in der Vergangenheit insgesamt nicht erkannt.
Das zweite Verfahren umfasst das Platzieren einer Lösung, in welcher zwei oder mehrere Arten von Molekülen gelöst sind, insbesondere beispielsweise biologische Moleküle, wie beispielsweise DNAs und Proteine, unter ein starkes elektrisches Feld, welches ein ungleichförmiges elektrisches Feld mit einer elektrischen Feldstärke von 500 KV/m oder höher ist. Es ist bisher unbekannt, dass betreffende Moleküle durch solch ein Verfahren voneinander getrennt werden können.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung:

(1)(a) ein Verfahren zum Trennen einer komplexen Substanz eines „spezifischen Moleküls" in einer Probe und einer „Sub stanz, die fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls" zu ändern, und die an dem „spezifischen Molekül" bindet, von anderen Molekülen als dem „spezifischen Molekül", umfassend das Bilden der komplexen Substanz aus dem „spezifischen Molekül" und der „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", und Unterwerfen der resultierenden Reaktionsmischung, enthaltend die komplexe Substanz, einer Dielektrophorese, und Trennen der komplexen Substanz von den anderen Molekülen als dem „spezifischen Molekül"; und ein Verfahren zum Messen des „spezifischen Moleküls" in der separierten komplexen Substanz oder eines anderen Moleküls als dem „spezifischen Moleküls" in der Probe; und
(b) ein Verfahren zum Trennen einer komplexen Substanz eines „spezifischen Moleküls" in einer Probe, einer „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" und einer „Substanz, die fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", welches an dem „spezifischen Molekül" bindet, von der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet", welche nicht in der Bildung der komplexen Substanz involviert ist, umfassend das Kontaktieren der Probe, enthaltend das „spezifische Molekül", mit der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" und der „Substanz, welche geeignet ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", um die komplexe Substanz zu bilden, und Unterwerfen der resultierenden Reaktionsmischung, enthaltend die komplexe Substanz, einer Dielektrophorese und Trennen der komplexen Substanz von der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet", welche nicht in die Bildung der komplexen Substanz involviert ist; und
(c) ein Verfahren zum Bestimmen einer Menge einer Komponente in der Probe, umfassend das Kontaktieren einer Probe, enthaltend ein „spezifisches Molekül", mit einem „spezifischen Molekül, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist" und einer „Substanz, welche geeignet ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern, welche an dem spezifischen Molekül bindet, um eine markierte komplexe Substanz des „spezifischen Moleküls, welches mit der markierenden Substanz markiert ist" und der „Substanz, welche geeignet ist, die die lektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", das Unterwerfen der resultierenden Reaktionsmischung, enthaltend die markierte komplexe Substanz einer Dielektrophorese, das Trennen der markierten komplexen Substanz von dem „spezifischen Molekül, welches mit der markierenden Substanz markiert ist", welche nicht in der Bildung der komplexen Substanz involviert ist, das Messen des „spezifischen Moleküls, welches durch die markierende Substanz markiert ist" in der separierten markierten komplexen Substanz oder des „spezifischen Moleküls, welches mit der markierenden Substanz markiert ist", welche nicht in der Bildung der komplexen Substanz involviert ist, und das Bestimmen der Menge der Komponente in der Probe auf der Basis des Messergebnisses; und
(d) ein Kit zum Messen einer Komponente in einer Probe für die Verwendung in den Verfahren (a) bis (c), umfassend eine „Substanz, welche geeignet ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" in der Probe, welche eine komplexe Substanz mit dem „spezifischen Molekül" bilden kann;

Insbesondere wird ein Verfahren zum Detektieren eines Moleküls, welches in einer Probe zu messen ist, beschrieben, welches das Reagieren einer flüssigen Probe, in welcher ein „zu messendes Molekül" gelöst ist, und einer Lösung, in welcher eine „Substanz, welche spezifisch an dem zu messenden Molekül bindet" gelöst ist, umfasst, um eine Lösung zu erhalten, in welcher eine komplexe Substanz des „zu messenden Moleküls" und einer „Substanz, welche spezifisch an dem zu messenden Molekül bindet", und der „Substanz, welche spezifisch an dem zu messenden Molekül bindet", welche nicht in der Reaktion involviert ist, gelöst sind, Platzieren der Lösung unter ein ungleichförmiges elektrisches Feld mit einer elektrischen Feldstärke von 500 KV/m oder höher, wobei das Feld durch Elektroden gebildet wird, welche eine Struktur aufweisen, welche geeignet ist, ein horizontales und vertikales ungleichförmiges elektrisches Feld zu bilden, Trennen der komplexen Substanz von der „Substanz, welche spezifisch an dem zu messenden Molekül bindet", welche nicht in die Reaktion involviert ist, und Messen der „Substanz, welche spezifisch an dem zu messenden Molekül bindet" in der komplexen Substanz oder der „Substanz, welche spezifisch an dem zu messenden Molekül bindet", welche nicht in die Reaktion involviert ist; und ein Verfahren zum Messen einer zu messenden Substanz in einer Probe, umfassend das Reagieren einer flüssigen Probe, enthaltend ein „zu messendes Molekül", ein „zu messendes Molekül, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist", und einer „Substanz, welche spezifisch an dem zu messenden Molekül bindet", um eine Lösung zu erhalten, welche eine komplexe Substanz des „zu messenden Moleküls, welches durch eine markierende Substanz markiert ist", und der „Substanz, welche spezifisch an dem zu messenden Molekül bindet", eine komplexe Substanz des „zu messenden Moleküls" und der „Substanz, welche spezifisch an dem zu messenden Molekül bindet" und des „zu messenden Moleküls, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist", welche nicht in die Reaktion involviert ist, zu erhalten, Platzieren der erhaltenen Lösung unter ein ungleichförmiges elektrisches Feld mit einer elektrischen Feldstärke von 500 KV/m oder höher, wobei das Feld durch Elektroden gebildet wird, welche eine Struktur aufweisen, welche geeignet ist, ein horizontales und vertikales ungleichförmiges elektrisches Feld zu bilden, Trennen der komplexen Substanz des „zu messenden Moleküls, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist" und der „Substanz, welche spezifisch an dem zu messenden Molekül bindet" von dem „zu messenden Moleküls, welches durch eine markierende Substanz markiert ist", welche nicht in die Bildung des Komplexes involviert ist, und dann Messen des „zu messenden Moleküls, welches durch eine markierende Substanz markiert ist" in der komplexen Substanz oder dem „zu messenden Molekül, welches durch eine markierende Substanz markiert ist", welche nicht in die Bildung der komplexen Substanz involviert ist, um die Menge des zu messenden Moleküls in der Probe zu bestimmen, basierend auf den Ergebnissen.
Die oben beschriebenen und anderen Ziele und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung klarer werden:
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Darstellung, welche das Prinzip der Dielektrophorese zeigt.
2 ist eine Darstellung, welche spezifische Beispiele von Elektroden zeigt, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
3 ist eine Darstellung, welche eine Ausführungsform der Elektrodensubstrate zeigt, welche eine Strombahn aufweisen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
4 ist eine schematische Darstellung des Dielektrophorese-Elektrodensubstrats, welches im Referenzbeispiel 1 hergestellt wurde.
5 ist eine schematische Darstellung der Elektrode, welche im Referenzbeispiel 1 hergestellt wurde.
6 ist eine schematische Darstellung des Elektrodensubstrats, welches die Strombahn aufweist, welches im Referenzbeispiel 2 hergestellt wurde.
7 ist eine schematische Darstellung des Schnittes entlang der Linie a-a' von 6.
8 ist ein Graph, welcher die Beziehung zwischen den Biotin-Konzentrationen und den Einfangraten, erhalten in Beispiel 1, zeigt.
9 zeigt Fluoreszenzbilder auf der Elektrode, erhalten in Beispiel 2, welche mit einem Lasermikroskop vor und während dem Anlegen eines elektrischen Feldes aufgenommen wurden.
10 ist ein Graph, welcher die Beziehung zwischen AFP-Konzentrationen und den Bild-Output-Konzentrationen, erhalten in Beispiel 2, zeigt.
11 ist ein Graph, welcher das Verhältnis zwischen den AFP-Konzentrationen im Serum und den Bildanalyse-Konzentrationen, erhalten in Beispiel 2, zeigt.
12 ist eine schematische Darstellung der Elektrode vor und während dem Anlegen eines elektrischen Feldes und ein Fluoreszenz-Mikroskop-Foto während dem Anlegen eines elektrischen Feldes, erhalten in Beispiel 3.
13 ist ein Graph, welcher die Veränderungen über die Zeit der Menge der Fluoreszenz beim Auslass der Strombahn, erhalten durch die Verwendung einer markierten λ-DNA-Lösung im experimentellen Beispiel 2, zeigt.
14 ist ein Graph, welcher Veränderungen über die Zeit der Menge der Fluoreszenz beim Auslass der Strombahn zeigt, erhalten durch die Verwendung einer markierten Oligonukleotid-Lösung im experimentellen Beispiel 2.
15 ist ein Graph, welcher die Beziehung zwischen der elektrischen Feldstärke und den Einfangraten einer markierten λ-DNA, erhalten in Beispiel 4, zeigt.
16 ist ein Graph, welcher das Verhältnis zwischen der elektrischen Feldstärke und den Einfangraten einer markierten IgM oder einer markierten BSA, erhalten in Beispiel 5, zeigt.
17 ist ein Graph, welcher das Verhältnis zwischen biotin-markierten λ-DNA-Konzentrationen und den Einfangraten, erhalten in Beispiel 6, zeigt.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun beschrieben.
Dielektrophoretische Kräfte sind Kräfte, welche aus dem Phänomen resultieren, welches unten beschrieben wird.
Und zwar, wie in 1 gezeigt, hat ein neutrales Molekül, welches in einem elektrischen Feld platziert ist, eine positiv induzierte Polarisationsladung +q stromabwärts des elektrischen Feldes bzw. eine negativ induzierte Polarisationsladung –q stromaufwärts des elektrischen Feldes, und dadurch empfängt +q eine Kraft von +qE von dem elektrischen Feld E und dieser Anteil wird stromabwärts in dem elektrischen Feld gezogen, wobei –q eine Kraft von –qE von dem elektrischen Feld E empfängt und dieser Anteil wird stromaufwärts in dem elektrischen Feld gezogen. Falls das Molekül neutral ist, weisen +q und –q gleiche absolute Werte auf, und wenn das elektrische Feld ungeachtet der Anteile gleichförmig ist, befinden sich beide empfangenen Kräfte in einer Balance und daher bewegen sich die Moleküle nicht. In dem Fall jedoch, bei dem das elektrische Feld ungleichförmig ist, wie in 1 gezeigt, wird eine Anziehungskraft gegen ein starkes elektrisches Feld größer, wobei das Molekül gegen die starke Seite des elektrischen Feldes geführt wird. Dieses Phänomen, bei dem neutrale Moleküle sich unter einem ungleichförmigen elektrischen Feld bewegen, wird Dielektrophorese (DEP) genannt und die Kraft, welche durch die Moleküle empfangen wird während dieser Zeit, wird dielektrophoretische Kraft genannt. Falls die Moleküle geladene Moleküle sind, ist die Art der Bewegung eine solche, wie umfassend elektrophoretische Kräfte zusammen mit dielektrophoretischen Kräften.
Proben, auf die die vorliegende Erfindung angewandt werden kann, umfassen Proben, abgeleitet von lebenden Organismen, wie beispielsweise Körperflüssigkeiten enthaltend Serum, Plasma, Gehim-Rückenmarksflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, Lymphe, etc., Exkrete, einschließlich Urin, Fäzes, etc., und behandelte Materialien da von. Behandelte Materialien schließen wässrige Lösungen dieser Proben ein, abgeleitet von einem lebenden Organismus im Wasser, Puffer oder dergleichen, oder diese rekonstituiert durch geeignetes Lösen oder Suspendieren von Molekülen wie unten beschrieben von diesen organismus-abgeleiteten Proben in Wasser, Puffer oder dergleichen. Proben, auf die die vorliegende Erfindung ebenfalls angewandt werden kann, enthalten solche, enthaltend die oben beschriebenen Moleküle, welche chemisch synthetisiert sind.
Das erste Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung (nachfolgend als Ausführungsform ➀ bezeichnet), bezieht sich auf ein Verfahren zum Trennen eines spezifischen Moleküls in einer solchen Probe wie oben beschrieben von anderen koexistierenden Molekülen und zusätzlich zum Bestimmen des separierten Moleküls, und einen Kit zur Verwendung bei solch einem Verfahren.
Derartige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen: (a) eines, gekennzeichnet durch Bilden einer komplexen Substanz eines „spezifischen Moleküls in einer Probe" und einer „Substanz, welche geeignet ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", welche an dem „spezifischen Molekül" bindet, (b) eine, gekennzeichnet durch Bilden einer komplexen Substanz eines „spezifischen Moleküls in einer Probe", einer „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet", und einer „Substanz, welche geeignet ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", welche an dem „spezifischen Molekül" bindet, und (c) eine, gekennzeichnet durch Bilden einer komplexen Substanz von entweder einem „spezifischen Molekül" in einer Probe oder einem „spezifischen Molekül, welches durch eine markierende Substanz markiert ist" und einer „Substanz, welche geeignet ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", welche an dem „spezifischen Molekül" bindet, und dergleichen.
Bei all diesen Ausführungsformen enthält ein „spezifisches Molekül" ein Molekül, welches zur Messung bestimmt ist (auch als zu messendes Molekül bezeichnet) und ein anderes Molekül als das zu messende Molekül (auch als nicht zu messendes Molekül bezeichnet).
Spezifische Moleküle (zu messende Moleküle) enthalten zum Beispiel Nukleotidketten (Oligonukleotidketten, Polynukleotidketten), Chromosomen, Peptidketten (zum Beispiel C-Peptide, Angiotensin I, und dergleichen), Proteine (zum Beispiel Serumproteine, wie beispielsweise Immunoglobulin A (IgA), Immunoglobulin E (IgE), Immunoglobulin G (IgG), β₂-Mikroglobulin, Albumin und Ferritin; Enzymproteine, wie beispielsweise Amylase, Alkinphosphatase und γ-Glutamyltransferase; antivirale Antikörper bis Viren, wie beispielsweise Rubella-Virus, Herpes-Virus, Hepatitis-Virus, ATL-Virus und AIDS-Virus und antigene Substanzen, abgeleitet von diesen Viren; Antikörper bis verschiedene Allergene; Lipide, wie beispielsweise Lipoproteine; und Proteasen, wie beispielsweise Trypsin, Plasmin und Serinproteasen); Zuckerketten (zum Beispiel Zuckerketten von α-Fetoprotein, CA19-9, prostata-spezifisches Antigen, karzinoembryonisches Antigen, Substanzen mit einzelnen Zuckerketten, hergestellt durch Krebszellen, Lecitin (zum Beispiel Concanavalin A, Lens-Culinaris-Lecitin, Phaseolus-Vulgaris-Lecitin, Dutura-Stramonium-Lecitin, Weizenkeimlecitin und dergleichen.
Zusätzlich enthalten spezifische Moleküle (zu messende Moleküle) auch Moleküle, welche als zwei oder mehr Arten von Substanzen existieren, welche die selbe Funktion aufweisen, oder Moleküle, welche als zwei oder mehr Arten von Substanzen existieren, welche eine gleiche Struktur aufweisen, jedoch unterschiedliche Funktion haben, wie beispielsweise Isozyme und Hormone, wie beispielsweise Enzyme, wie beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, Säurephosphatase, γ-Glutamyltransferase (γ-GTP), Lipase, Kreatinkinase (CK), Lactatdehydrogenase (LDH), Glutaminoxalessigsäuretransaminase (GPT), Renin, Proteinkinase, Tyrosinkinase; physiologisch-aktive Substanzen, wie beispielsweise Steroidhormone, menschliches Choriongonadotropin (hCG), Prolaktin, die Schilddrüse aktivierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH); mit Krebs verbundene Antigene wie beispielsweise prostata-spezifisches Antigen (PSA), α²-Makroglobulin, karzinoembryonisches Antigen (CEA), α-Fetoprotein und dergleichen.
Eine „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften zu ändern", schließt in der vorliegenden Erfindung (auch bezeichnet als eine, die Trennung verbessernde Substanz) eine Substanz ein, welche durch Binden an ein spezifisches Molekül (zu messendes Molekül), um einen Komplex mit dem spezifischen Molekül zu binden, Unterschiede im Verhalten bei der dielektrophoretischen Verarbeitung zwischen dem spezifischen Molekül und den anderen koexistierenden Substanz bewirkt (nicht zu messende Moleküle, zum Beispiel eine oder mehrere Arten von Substanzen, welche nicht in die Bildung des Komplexes involviert sind): zum Beispiel 1) eine Substanz, welche ein Ergebnis bewirken kann, das jedes von beiden auf der Dielektrophorese-Elektrode gefangen ist und die anderen nicht gefangen werden, und insbesondere eine Substanz, welche Veränderungen in der Bewegungsgeschwindigkeit des spezifischen Moleküls und der anderen koexistierenden Substanzen bewirken kann, zum Beispiel in dem Falle des Einsetzens einer so genannten Dielektrophorese-Chromatographie-Vorrichtung (Field-Flow-Fraktionierungsvorrichtung), bei der, wie unten beschrieben, eine Trennung anhand der Interaktion zwischen dielektrophoretischen Kräften, verursacht durch die Moleküle in dem elektrischen Feld, und der Molekularbewegung, und besonders bevorzugt eine Substanz, mit der jede von diesen auf der Elektrode gefangen werden kann und die anderen auf der Dielektrophorese-Elektrode ohne auf der Elektrode gefangen zu werden hindurch geführt werden können; oder 2) eine Substanz, welche ein Ergebnis bewirken kann, dass jede der beiden negative dielektrophoretische Kräfte empfängt und die anderen positive dielektrophoretische Kräfte empfangen, und insbesondere eine Substanz, welche zum Beispiel nur dem spezifischen Molekül erlauben kann, sich an einer bestimmten Position auf der dielektrophoretischen Elektrode anzusammeln, und besonders bevorzugt eine Substanz, welche einer von diesen erlauben kann, sich an einer Region auf der Dielektrophorese-Elektrode mit einer starken elektrischen Feldstärke anzusammeln durch positive dielektrophoretische Kräfte, und den anderen erlaubt, sich an einer Region auf der Dielektrophorese-Elektrode mit schwacher elektrischer Feldstärke anzusammeln durch negative dielektrophoretische Kräfte; oder ähnliches.
Solch eine Substanz enthält anorganische Metalloxide, wie beispielsweise Siliziumdioxid und Aluminiumoxid; Metalle, wie beispielsweise Gold, Titan, Eisen und Nickel; anorganische Metalloxide und dergleichen mit funktionellen Gruppen, eingeführt durch einen Silan-Kopplungsprozess und dergleichen; lebende Dinge, wie beispielsweise verschiedene Mikroorganismen und eukaryotische Zellen; Polysacharide, wie beispielsweise Agarose, Zellulose, unlösliches Dextran; synthetische makromolekulare Verbindungen wie beispielsweise Polystyrollatex, Styrol-Butadien-Copolymer, Styrol-Methacrylat-Copolymer, Acrolein-Ethylen-Glykoldimethacrylat-Copolymer, Styrol-Styrolsufonat-Latex, Polyacrylamid, Polyglycid-Methacrylat, mit Polyacrolein überzogene Partikel, querverbundenes Polyacrylonitril, Acryl- oder Acrylester-Copolymer, Acrylonitril-Butadien, Vinyl-Chlorid-Acryl-Ester und Polyvinyl-Acetat-Acrylat; biologische Moleküle, wie beispielsweise Erythrocyten, Zucker, Nukleinsäure, Proteine und Lipide und ähnliches.
Diese Substanzen werden gewöhnlich in der Form von feinen Partikeln bis Granulat verwendet.
Eine „Substanz, welche an einem spezifischen Molekül bindet", welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, darf nicht besonders begrenzt werden und enthält eine Substanz, welche aus einem „spezifischen Molekül" in einer Probe eine komplexe Substanz aus dem „spezifischen Molekül", einer „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" und einer „spezifischen Substanz, die fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften zu ändern" bilden kann, und welche nicht im wesentlichen eine komplexe Substanz aus „anderen Molekülen als dem spezifischen Molekül", der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" und der „spezifischen Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften zu ändern" bildet. Kurz gesagt, so lange die Substanz nicht die letztere komplexe Substanz aus den oben genannten drei Substanzen bildet, kann sie für diesen Zweck benutz werden, selbst wenn sie an andere Moleküle als das „spezifische Molekül" bindet. Tatsächlich wird eine „Substanz, welche spezifisch an das spezifische Molekül bindet" bevorzugt verwendet.
Eine „Substanz, welche an ein spezifisches Molekül bindet" betrifft eine Substanz, welche an ein „spezifisches Molekül" durch wechselseitige Reaktionen bindet, wie beispielsweise einer „Antigen"-„Antikörper"-Reaktion, einer „Zuckerketten"-„Lecitin"-Reaktion, einer „Enzym"-„Inhibitor"-Reaktion und einer „Protein"-„Peptidketten"-Reaktion, einer „Chromosom- oder Nukleotidketten"-„Nukleotidketten"-Reaktion. Wenn einer der Partner ein spezifisches Molekül ist (zu messendes Molekül) in jeder oben beschriebenen Kombination, ist der andere eine „Substanz, welche an ein spezifisches Molekül (zu messendes Molekül) bindet", wie oben beschrieben. Wenn zum Beispiel ein spezifisches Molekül (zu messendes Molekül) ein „Antigen" ist, ist eine „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (zu messendes Molekül)" ein „Antikörper", und wenn ein spezifisches Molekül (zu messendes Molekül) ein „Antikörper" ist, ist eine „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül (zu messendes Molekül) bindet" ein „Antigen" (andere, oben beschriebene Kombinationen haben ähnliche Beziehungen).
Es ist geeignet, dass die „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül (zu messendes Molekül) bindet" wenigstens an dem „spezifischen Molekül" bindet, und sie bindet nicht notwendigerweise spezifisch nur an dem spezifischen Molekül. Jedoch in dem Falle, bei dem eine „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül (zu messendem Molekül) bindet" nicht eine Substanz ist, welche nicht spezifisch an dem spezifischen Molekül bindet, ist die „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", welche in der Kombination zu verwenden ist, im allgemeinen eine solche, welche spezifisch an dem „spezifischen Molekül" bindet, oder eine, welche Eigenschaften besitzt, spezifisch an einer neuen Seite zu binden, welche durch Bilden einer komplexen Substanz aus dem „spezifischen Molekül" und der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (zu messendes Molekül)" gebildet ist.
Solch eine „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül (zu messendes Molekül) bindet" ist im allgemeinem eine solche, welche gemessen (detektiert) oder durch eine markierende Substanz durch bestimmte Verfahren markiert werden kann. Die Verwendung einer Substanz, welche eine solche Eigenschaft aufweist, wird es ermöglichen, ein spezifisches Molekül (zu messendes Molekül) in einer Probe zu messen (detektieren). In dem Falle, bei dem ein spezifisches Molekül (zu messendes Molekül) selbst durch bestimmte Verfahren detektiert werden kann (zum Beispiel ein Enzym oder dergleichen), oder bei dem ein spezifisches Molekül (zu messendes Molekül) direkt an eine markierende Substanz ohne (via) eine „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" binden kann, kann das spezifische Molekül (zu messendes Molekül) in einer Probe gemessen (detektiert) werden, selbst wenn die „Substanz, welche an das spezifische Molekül bindet" keine solche Eigenschaft, wie oben beschrieben, besitzt, oder die „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" nicht eingesetzt wird. Beispielsweise können Enzyme, Farbstoffe, fluoreszierende Substanzen, lumineszierende Substanzen, Substanzen mit Absorption im ultravioletten Bereich und ähnliche selbst durch bestimmte Verfahren detektiert werden.
Markierende Substanzen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind alle Substanzen, welche gewöhnlich im Stand der Technik verwendet werden, einschließlich Enzym-Immunoessay (EIA), Radio-Immunoessay (RIA), Fluoro-Immunoessay (FIA), Hybridisierung, und ähnliches, und sie werden erläutert durch Enzyme, wie beispielsweise alkalische Phosphatase (ALP), β-Galactosidase (β-Gal), Peroxidase (POD), Mikroperoxidase, Glukoseoxidase (GOD), Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH), Malatdehydrogenase und Luciferase; Farbstoffe, wie beispielsweise Coomassie Brilliant Blue R250 und Methylorange; Radioisotope, wie beispielsweise ^99mTc, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹⁴C, ³H, ³²P und ³⁵S; fluoreszierende Substanzen, wie beispielsweise Fluorescein, Rhodamin, Dansyl, Fluorescamin, Coumarin, Naphtylamin oder deren Derivate und Europium (Eu); lumineszierende Substanzen, wie beispielsweise Luciferin, Isoluminol, Luminol und Bis-(2,4,6-trifluorphenyl)-oxalat; Substanzen, welche Absorption im ultravioletten Bereich aufweisen, wie beispielsweise Phenol, Naphtol, Anthracen und deren Derivate; Substanzen, welche Eigenschaften als Spin-Labeling-Mittel aufweisen, veranschaulicht durch Komponenten mit Oxyl-Gruppen, wie beispielsweise 4-Amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, 3-amino-2,2,5,5-tetramethylpyrroridin-1-oxyl und 2,6-di-t-butyl-α-(3,5-di-t-butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-yliden)-p-tolyloxyl und ähnliches.
Das Markieren eines spezifischen Moleküls (zu messenden Moleküls) oder einer „Substanz, welche an ein spezifisches Molekül bindet" durch eine markierende Substanz kann durchgeführt werden durch irgend eine herkömmliche Methode aus dem Stand der Technik, wie beispielsweise bekannte Markierungsverfahren, die gewöhnlich eingesetzt werden in EIA, RIA, FIA, Hybridisierung oder dergleichen, welche per se bekannt sind [zum Beispiel Ikagaku Zikken Koza (Methods in Medical an Chemical Experiments) vol. 8, herausgegeben von Y. Yamamura, erst ed., Nakayama-Shoten, 1971; A. Kuwao, Illustrative Fluorescent Antibodies, erste ed., Softscience Inc., 1983; Enzyme Immunoassy, herausgegeben von E. Ishikawa, T. Kawai, und K. Miyai, dritte ed., Igaku-Shoin, 1987; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite ed., J. Sambrook, E. F. Fritsch, und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press und dergleichen] und herkömmliche Verfahren, bei denen eine Reaktion von Avidin (oder Streptavidin) und Biotin eingesetzt wird.
Bei der oben genannten Ausführungsform (a) werden, um eine komplexe Substanz aus einem „spezifischen Molekül in einer Probe" und einer „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", eine Probe, enthaltend ein „spezifisches Molekül" und eine „Substanz, welche geeignet ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" gelöst, dispergiert bzw. suspendiert, zum Beispiel in Wasser oder Pufferlösungen, wie beispielsweise Tris(Hydroxymethylaminomethan)-Puffer, Good's-Puffer, Phosphatpuffer, Boratpuffer und ähnliches, um flüssige Materialien zu erhalten, und die flüssigen Materialien werden gemischt und mit einer anderen kontaktiert. Diese Probe und Substanzen können gelöst, dispergiert oder auf einmal suspendiert werden. In dem Fall, bei dem eine Probe, welche ein „spezifisches Molekül" enthält, flüs sig ist, kann eine „Substanz, welche geeignet ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" direkt mit der Probe gemischt werden.
Die Bildung eines Komplexes in den oben genannten Ausführungsformen (b) und (c) der vorliegenden Erfindung kann auch auf eine ähnliche Art und Weise wie oben beschrieben, durchgeführt werden.
Bei der oben genannten Ausführungsform (b) kann, um eine komplexe Substanz aus einem „spezifischen Molekül in einer Probe", einer „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" und einer „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" zu bilden, eine Probe, enthaltend ein „spezifisches Molekül", eine „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" und eine „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", gelöst, dispergiert bzw. suspendiert werden, beispielsweise in Wasser oder Puffern, wie beispielsweise Tris(Hydroxymethylaminomethan)-Puffern, Good's-Puffer, Phosphatpuffer, Boratpuffer und dergleichen, um flüssige Materialien zu erhalten, und die flüssigen Materialien werden gemischt und mit einer anderen kontaktiert. Diese Probe und Substanzen können gelöst, dispergiert oder auf einmal suspendiert werden. Alternativ wird eine komplexe Substanz aus einer „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" und einer „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", zuerst auf eine ähnliche Art und Weise wie oben beschrieben gebildet, und dann wird ein flüssiges Material, welches die komplexe Substanz enthält, weiter gemischt und mit einem flüssigen Material einer Probe kontaktiert, welche ein spezifisches Molekül enthält, hergestellt wie vorher beschrieben. Alternativ werden eine Probe, welche ein „spezifisches Molekül" enthält, und eine „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" miteinander kontaktiert, um eine komplexe Substanz aus diesem zu bilden, und das Resultat wird dann mit einer „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" kontaktiert.
Wenn eine Probe, welche ein „spezifisches Molekül" enthält, flüssig ist, darf sie nicht beispielsweise in Wasser oder Pufferlösungen, wie oben beschrieben, gelöst, dispergiert oder suspendiert werden.
Bei der oben genannten Ausführungsform (c) kann, um eine komplexe Substanz aus einem „spezifischen Molekül in einer Probe" oder einem „spezifischen Molekül, welches durch eine markierende Substanz markiert ist" und einer „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" zu erhalten, eine Probe, welche ein „spezifisches Molekül", ein „spezifisches Molekül, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist" beispielsweise in Wasser oder Pufferlösungen, wie beispielsweise Tris(Hydroxymethylaminomethan)-Puffer, Good's-Puffer, Phosphatpuffer, Buratpuffer und dergleichen gelöst, dispergiert bzw. suspendiert werden, um flüssige Materialien zu erhalten, und diese flüssigen Materialien können gemischt und mit einer anderen kontaktiert werden. Das gemischte-flüssige Material kann gemischt und mit einem flüssigen Material kontaktiert werden, erhalten durch Lösen, Dispergieren oder Suspendieren einer „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" beispielsweise in Wasser oder Pufferlösungen, wie beispielsweise Tris(Hydroxymethylaminomethan)-Puffer, Good's-Puffer, Phosphatpuffer, Buratpuffer oder dergleichen. Alternativ können solche Proben und Substanzen gelöst, dispergiert oder auf einmal suspendiert werden.
Wenn eine Probe, welche ein „spezifisches Molekül" enthält, flüssig ist, wie oben beschrieben, darf sie nicht beispielsweise in Wasser oder Pufferlösungen wie Tris(Hydroxymethylaminomethan)-Puffern oder Good's-Puffern gelöst, dispergiert oder suspendiert werden.
Der Komplex, welcher flüssiges Material enthält und auf diese Weise erhalten wurde, wird anschließend Dielektrophorese unterzogen.
(Allgemeine Gleichung der dielektrophoretischen Kräfte)
Das Äquivalent-Dipolmoment-Verfahren ist ein Verfahren des Analysierens von dielektrophoretischen Kräften durch Substituieren von induzierten Ladungen für einen äquivalenten elektrischen Dipol. Gemäß diesem Verfahren ist die dielektrophoretische Kraft F_d, welche ein spherischer Partikel mit einem Radius von a, welcher in einem elektrischen Feld E platziert ist, empfängt, gegeben durch: Fd = 2πa3εmRe[K*(ω)]v(E2) (1)wobei K*(ω) unter Verwendung der Kreisfrequenz der angelegten Spannung ω und des imaginären Element j, wie folgt ausgedrückt ist: K*(ω) = εp* – εm*/εp* + 2εm* (2) εp* = εp – jσp/ω, εm* = εm – jσm/ω (3)wobei ε_p, ε_m, σ_p, und σ_m die absolute Dielektrizitätskonstante und Leitfähigkeit des Partikels und der Lösung sind, und die komplexen Quantitäten sind mit * gekenn
Das Gleichgewicht (1) zeigt an, dass wenn Re[K*(ω)] > 0 ist, die Kraft derart wirkt, dass das elektrische Feld den Partikel gegen eine starke Seite (positive Dielektrophorese, positive DEP) anzieht, und wenn Re[K*(ω)] < 0, die Kraft derart wirkt, dass das elektrische Feld den Partikel gegen eine schwache Seite (negative Dielektrophorese, negative DEP) drückt.
Von dem oben genannten allgemeinen Gleichgewicht der dielektrophoretischen Kräfte ist es offenbar, dass Parameter, welche in dielektrophoretische Kräfte von Substanzen, welche dielektrophoretische Kräfte empfangen, involviert sind, im allgemeinen die absolute Dielektrizitätskonstante und Leitfähigkeit dieser Substanzen und des Mediums, die Größe der Substanzen und die Frequenz des angelegten elektrischen Feldes sind. Diese Parameter sollten geeignet gesetzt werden, abhängig von der Art der die Trennung verbessernden Substanzen, an welche eine detektierende komplexe Substanz gebunden ist, und der markierenden Substanzen, unter Verwendung der Detektion des spezifischen Moleküls (zu messendes Molekül). Obwohl es nicht verallgemeinert werden kann, ist die Leitfähigkeit des Mediums, welches eingesetzt wird, gewöhnlich nicht mehr als 13 mS/cm (wie PBS-Konzentration) und vorzugsweise nicht mehr als 1 mS/cm. Hinsichtlich der Größe der die Trennung verbessernden Substanzen, ist im Falle von Partikeln eine durchschnittliche Partikelgröße gewöhnlich nicht mehr als 1 mm und vorzugsweise 0,025–100 μm, und in dem Fall von biologischen Molekülen ist die Größe gewöhnlich mehr als 10 nm und vorzugsweise mehr als 500 nm (berechnet von Größen von normalen Proteinmolekülen von wenigen bis einigen 10 Nanometern).
(Elektrisches Feld, verwendet zur Dielektrophoretischen Trennung unter Einsatz von die Trennung verbessernden Substanzen)
Aus der oben genannten allgemeinen Gleichung der Dielektrophorese kann behauptet werden, dass Parameter, welche in dielektrophoretische Kräfte eines angelegten elektrischen Feldes involviert sind, die Stärke des angelegten elektrischen Feldes und der angelegten Frequenz sind. Insbesondere sind die Parameter geeignet zu setzen gemäß dem spezifischen Molekül (zu messendes Molekül), selbst wenn die Substanzen identisch sind, weil die angelegte Frequenz Änderungen in den positiven und negativen dielektrophoretischen Eigenschaften bewirken kann. Diese Parameter sollten geeignet gesetzt werden, abhängig von der Art der, die Trennung verbessernden Substanzen, an welche eine detektierende komplexe Substanz gebunden hat, und den markierenden Substanzen, welche für die Detektion des spezifischen Moleküls (zu messendes Molekül) verwendet werden. Obwohl es nicht allgemein gesagt werden kann, ist die angelegte elektrische Feldstärke gewöhnlich nicht mehr als 3,5 MV/m und vorzugsweise nicht mehr als 1,0 MV/m, wenn eine, die Trennung verbessernde Substanz der Dielektrophorese eine positive Dielektrophorese hat. Wenn eine, die Trennung verbessernde Substanz der Dielektrophorese eine negative Dielektrophorese hat, ist die elektrische Feldstärke nicht mehr als 3,5 MV/m. Die angelegte Frequenz ist gewöhnlich im Bereich von 100 Hz bis 10 MHz und vorzugsweise 1 kHz bis 10 MHz.
Bei der vorliegenden Erfindung kann das anzulegende elektrische Feld sowohl ein Wechselstromfeld als auch ein Gleichstromfeld sein, und es ist gewöhnlich bevorzugt, das Wechselstromfeld zu verwenden.
(Trennungsverfahren mit trennungsverbessernden Substanzen der Dielektrophorese)
Trennungsverfahren eines spezifischen Moleküls, bei denen trennungsverbessernde Substanzen eingesetzt werden, können in zwei Arten klassifiziert werden, wie unten beschrieben ist:
(Trennungsverfahren 1)
Zuerst, in dem Fall, in dem eine trennungsverbessernde Substanz eine Substanz ist, welche die selben positiven oder negativen dielektrophoretischen Kräfte, die andere Moleküle als das spezifische Molekül (zu messendes Molekül) aufweist [zum Beispiel eine freie Markierungssubstanz (zum Beispiel eine spezifische Substanz, welche durch eine markierende Substanz markiert ist, welche nicht in eine komplexe Substanz involviert ist) welche eingesetzt ist für die Detektion des spezifischen Moleküls und dergleichen] und die durch dielektrophoretische Kräfte beeinflusst ist, die im Wesentlichen größer sind als das spezifische Molekül (zu messendes Molekül), empfangen nur die trennungsverbessernde Substanz und das Molekül, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet große dielektrophoretische Kräfte und werden getrennt.
Das heißt, das zum Beispiel (1) das spezifische Molekül von den anderen Molekülen als dem spezifischen Molekül getrennt werden kann durch Einstellen der elektrischen Feldstärke und der Medienbedingungen in einer solchen Weise, dass die trennungsverbessernde Substanz und das Molekül, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet, sich an einer bestimmten Position auf der Dielektrophorese-Elektrode durch die dielektrophoretische Kräfte ansammeln und die anderen Moleküle als das spezifische Molekül (zu messende Molekül) [zum Beispiel eine freie Mar kierungssubstanz eingesetzt für die Detektion des spezifischen Moleküls und dergleichen] sich nicht ansammeln.
Ferner, zum Beispiel (2), kann eine Trennung ausgeführt werden unter Einsatz einer so genannten dielektrophoretischen Chromatographie-Vorrichtung (Feldfluss-Fraktionierungs-Vorrichtung), bei der eine Trennung durchgeführt wird mit der Interaktion zwischen den dielektrophoretischen Kräften, hervorgerufen auf den Molekülen von dem elektrischen Feld, wie unten beschrieben und der Molekularbewegung. Weil die trennungsverbessernde Substanz und das Molekül, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet, nur auf der Dielektrophorese-Trennungs-Elektrode durch dielektrophoretische Kräfte gefangen werden, oder weil Unterschiede stattfinden zwischen der Bewegungsgeschwindigkeit der trennungsverbessernden Substanz und des Moleküls, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet auf der einen Seite und der, der anderen Moleküle auf der anderen Seite, kann das spezifische Molekül in diesem Fall einfach von den anderen Molekülen als dem spezifischen Molekül (zu messenden Molekülen) getrennt werden.
(Trennungsverfahren 2)
Zweitens, in dem Falle, in dem eine trennungsverbessernde Substanz eine Substanz ist, welche verschiedene positive oder negative dielektrophoretische Kräfte von den anderen Molekülen als dem spezifischen Molekül aufweist [zum Beispiel eine markierende Substanz zur Verwendung bei Detektion des spezifischen Moleküls], das heißt, bei dem eine trennungsverbessernde Substanz positive dielektrophoretische Kräfte aufweist und die anderen Moleküle als das spezifische Molekül negative dielektrophoretische Kräfte aufweisen, oder andererseits eine trennungsverbessernde Substanz negative dielektrophoretische Kräfte aufweist und die anderen Moleküle als das spezifische Molekül positive dielektrophoretische Kräfte aufweisen, bewegen sich die trennungsverbessernde Substanz und das spezifische Molekül, welche an der trennungsverbessernden Substanz bindet auf der einen Seite und die anderen Moleküle als das spezifische Molekül auf der anderen Seite, zu unterschiedlichen elektrischen Feldregionen, und auf diese Weise kann das spezifische Molekül von den anderen Molekülen als dem spezifischen Molekül getrennt werden.
Das heißt, dass zum Beispiel (1) sich die trennungsverbessernde Substanz und das Molekül, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet, auf der einen Seite, und die anderen Moleküle als das spezifische Molekül auf der anderen Seite zu im wesentlichen unterschiedlichen Feldregionen respektive auf der Dielektrophorese-Elektrode durch dielektrophoretische Kräfte bewegen, sodass das spezifische Molekül von anderen Molekülen als dem spezifischen Molekül [zum Beispiel eine markierende Substanz zur Verwendung bei der Detektion des spezifischen Moleküls und dergleichen] getrennt werden kann.
(2) Ferner kann die Trennung durchgeführt werden zum Beispiel unter Verwendung einer Dielektrophorese-Chromatographie-Vorrichtung (Feldfluss-Fraktionierungs-Vorrichtung). In diesem Fall werden unter Bedingungen, bei denen die trennungsverbessernde Substanz und das spezifische Molekül, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet, positive dielektrophoretische Kräfte haben, und die anderen Moleküle als das spezifische Molekül negative dielektrophoretische Kräfte haben, die trennungsverbessernde Substanz und das spezifische Molekül, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet, auf der dielektrophoretischen Trennungselektrode durch dielektrophoretische Kräfte gefangen, und die anderen Moleküle als das spezifische Molekül werden nicht auf der Elektrode durch negative dielektrophoretische Kräfte gefangen. Auf der anderen Seite werden unter Bedingungen, bei denen die anderen Moleküle als das spezifische Molekül positive dielektrophoretische Kräfte haben, und die trennungsverbessernde Substanz und das spezifische Molekül, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet, negative dielektrophoretische Kräfte haben, die anderen Moleküle als das spezifische Molekül auf der Dielektrophorese-Trennungselektrode durch dielektrophoretische Kräfte gefangen, und die trennungsverbessernde Substanz und das spezifische Molekül, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet, werden nicht auf der Elektrode durch negative dielektrophoretische Kräfte gefangen. Auf diese Weise kann das spezifische gative dielektrophoretische Kräfte gefangen. Auf diese Weise kann das spezifische Molekül von den anderen Molekülen als dem spezifischen Molekül getrennt werden.
Als Dielektrophorese-Elektroden und dielektrophoretische Chromatographie-Vorrichtungen, welche in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, können alle solchen verwendet werden, welche gewöhnlich im Stand der Technik eingesetzt werden. Wie später diskutiert werden wird, weisen die Elektroden insbesondere eine Struktur auf, die geeignet ist, ein horizontales und vertikales ungleichförmiges elektrisches Feld zu bilden und schliessen eine Vorrichtung ein, welche mit der gerade beschriebenen Elektrode ausgerüstet ist.
Eine „trennungsverbessernde Substanz" wird gewöhnlich als gebunden an eine „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" verwendet, wobei die Substanz an das „spezifische Molekül" in einer Probe gebunden sein kann. Alternativ kann ein direktes Binden „trennungsverbessernder Substanz" an das „spezifische Molekül" durch chemische Bindungsverfahren durchgeführt werden, wie beispielsweise Verfahren zum Binden des spezifischen Moleküls durch eine funktionelle Gruppe, welche vorher in die Oberfläche der trennungsverbessernden Substanz eingeführt wird, Verfahren zum Binden des „spezifischen Moleküls" an die trennungsverbessernde Substanz über einen Linker und dergleichen. Als „Substanz, welche spezifisch an dem spezifischen Molekül bindet", welche in diesem Fall eingesetzt wird, kann dieselbe Substanz verwendet werden wie die „Substanz, welche spezifisch an dem spezifischen Molekül bindet", wie vorher beschrieben [es ist nicht erforderlich, dass sie selbst gemessen werden kann (detektiert) oder mit einer markierenden Substanz durch bestimmte Methoden markiert ist], oder eine Substanz, welche Eigenschaften besitzt, spezifisch an eine neue Stelle zu binden, gebildet durch Bilden einer komplexen Substanz des „spezifischen Moleküls" und der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet", oder dergleichen. Die Substanz, welche Eigenschaften besitzt, spezifisch an einer neuen Stelle zu binden, welche durch Bilden einer komplexen Substanz aus dem „spezifischen Molekül" und der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" gebildet ist, schließt zum Beispiel Anti körper, Peptidketten, Nukleotidketten und dergleichen ein, welche die komplexe Substanz aus dem „spezifischen Molekül" und der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet und die an der komplexen Substanz binden kann" erkennen kann.
Das Binden der „trennungsverbessernden Substanz" und der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" kann auf eine ähnliche Weise durchgeführt werden wie Verfahren zum Markieren des „spezifischen Moleküls" mit einer markierenden Substanz, wie oben beschrieben.
Wenn eine Substanz, welche Eigenschaften besitzt, spezifisch direkt an dem „spezifischen Molekül" zu binden, verwendet wird als eine „trennungsverbessernde Substanz", sind Verfahren, wie sie oben beschrieben sind, nicht erforderlich.
Eine derartige „trennungsverbessernde Substanz" schließt zum Beispiel Nukleinsäuren, Proteine, Lipide und dergleichen ein.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet „Trennen der komplexen Substanz von den anderen Molekülen als dem spezifischen Molekül enthalten in der Probe" nicht notwendigerweise, nur die „komplexe Substanz" zu trennen (isolieren) (zum Beispiel die komplexe Substanz des spezifischen Moleküls und die trennungsverbessernde Substanz), sondern bedeutet, eine oder mehrere Arten von Substanzen, die andere sind, als die „komplexe Substanz", welche in der Probe koexistiert, und von dem „spezifischen Molekül" zu trennen, abhängig von dem Zweck. In diesem Fall kann das „spezifische Molekül" als eine komplexe Substanz davon mit der trennungsverbessernden Substanz isoliert werden, wenn die Bedingungen geeignet gewählt sind und das Trennungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wiederholt wird. Kurz gesagt ist die Aufgabe, es zu ermöglichen, eine Menge von dem „spezifischen Molekül" oder den „anderen Molekülen als dem spezifischen Molekül" in der Probe zu messen.
Gemäß dem Trennungsverfahren der vorliegenden Erfindung, wie es oben beschrieben ist, kann das „spezifische Molekül" (einschließlich Fälle des Gesammeltwerdens als eine komplexe Substanz des spezifischen Moleküls und der trennungsverbessernden Substanz) oder die anderen Moleküle als die „spezifischen Moleküle" gesammelt werden.
In dem Fall von (1) des Trennungsverfahrens 1, wie oben beschrieben, können nämlich zum Beispiel „die anderen Moleküle als das spezifische Molekül" gesammelt werden durch Waschen der Elektrode mit einem geeigneten Puffer, welcher gewöhnlich im Stand der Technik eingesetzt wird, Wasser, oder dergleichen, während ein elektrisches Feld unter solchen Bedingungen angelegt wird, dass das spezifische Molekül als eine komplexe Substanz mit einer trennungsverbessernden Substanz an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen wird, und die anderen Moleküle werden nicht an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen, und dann kann das spezifische Molekül (eine komplexe Substanz des spezifischen Moleküls und der trennungsverbessernden Substanz) durch Unterbrechung des elektrischen Feldes und Waschen der Elektrode mit einem geeigneten Puffer, welcher gewöhnlich im Stand der Technik verwendet wird, Wasser, oder dergleichen, gesammelt werden.
Im Falle von (1) des Trennungsverfahrens 2, wie oben beschrieben, wandern die trennungsverbessernde Substanz und das Molekül, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet, auf der einen Seite und die anderen Moleküle als das spezifische Molekül auf der anderen Seite zu im wesentlichen unterschiedlichen Regionen des elektrischen Feldes respektive auf der Dielektrophorese-Elektrode durch dielektrophoretische Kräfte, sodass diese wandernden Moleküle separat und entsprechend gesammelt werden können.
In dem Fall, in dem die Trennung durch das Verfahren (2) des Trennungsverfahrens 1, welches oben beschrieben ist, durchgeführt wird, können das spezifische Molekül oder die anderen Moleküle jeweils durch Sammeln zunächst einer mobilen Phase, welche die anderen Moleküle als das spezifische Molekül enthält, welche kleine dielektrophoretische Kräfte empfangen und ohne an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen zu werden wandern, und danach durch Sammeln einer gewa schenen Lösung, welche das spezifische Molekül enthält, durch Bewegen des spezifischen Moleküls, welches hohe dielektrophoretische Kräfte empfängt, welches bei einer bestimmten Position auf der Elektrode während dem Anlegen des elektrischen Felds gefangen wird, durch Befreien von dem elektrischen Feld und Waschen der Elektrode mit einem geeigneten Puffer, welcher gewöhnlich im Stand der Technik verwendet wird, Wasser, oder dergleichen, gesammelt werden.
In dem Fall, bei dem die Trennung durch Verfahren (2) des Separationsverfahrens 2, wie oben beschrieben, durchgeführt wird, können das spezifische Molekül oder das andere Molekül jeweils gesammelt werden unter Bedingungen, bei denen die trennungsverbessernde Substanz und das spezifische Molekül, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet, positive dielektrophoretische Kräfte aufweisen und bei denen die anderen Moleküle als das spezifische Molekül negative dielektrophoretische Kräfte aufweisen, durch Sammeln zunächst einer mobilen Phase, welche die anderen Moleküle als das spezifische Molekül enthält, welche negative dielektrophoretische Kräfte aufweisen und ohne an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen zu werden wandern, und danach durch Sammeln einer gewaschenen Lösung, welche das spezifische Molekül enthält, durch Bewegen des spezifischen Moleküls mit positiven dielektrophoretischen Kräften, welches an einer bestimmten Position auf der Elektrode während dem Anlegen des elektrischen Feldes gefangen wird, durch Befreien von dem elektrischen Feld und Waschen der Elektrode mit dem geeigneten Puffer, welcher gewöhnlich im Stand der Technik verwendet wird, Wasser oder dergleichen. Alternativ kann das spezifische Molekül oder das andere Molekül jeweils unter Bedingungen gesammelt werden, bei denen die anderen Moleküle als das spezifische Molekül positive dielektrophoretische Kräfte aufweisen und die trennungsverbessernde Substanz und das spezifische Molekül, welches an der trennungsverbessernden Substanz bindet, negative dielektrophoretische Kräfte aufweisen, durch Sammeln zunächst einer mobilen Phase, welche das spezifische Molekül mit negativen dielektrophoretischen Kräften enthält, und durch Bewegen ohne an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen zu werden, und danach durch Sammeln einer gewaschenen Lösung, welche die anderen Moleküle als das spezifische Molekül enthält, durch Bewegen der Moleküle, welche positive dielektrophoretische Kräfte aufweisen und die an einer bestimmten Position auf der Elektrode während dem Anlegen des elektrischen Feldes gefangen sind, durch Befreien von dem elektrischen Feld und Waschen der Elektrode mit einem kleinen Puffer, welcher gewöhnlich im Stand der Technik verwendet wird, Wasser, oder dergleichen.
Puffer, welche eingesetzt werden können, umfassen Puffer, welche gewöhnlich im Stand der Technik eingesetzt werden, zum Beispiel Tris(Hydroxymethylaminometan)-Puffer, Good's-Puffer, Phosphatpuffer, Boratpuffer und dergleichen.
Eine komplexe Substanz der beiden Bestandteile, wie sie oben erwähnt sind (das „spezifische Molekül" und die „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern") kann nicht auf gewöhnliche Art und Weise von der „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" durch Dielektrophorese getrennt werden. Ferner kann eine komplexe Substanz der drei Bestandteile, wie oben erwähnt (das „spezifische Molekül" und die „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" und die „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern") nicht gewöhnlich von einer komplexen Substanz der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" und der „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" und der freien „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" durch Dielektrophorese getrennt werden.
Selbst wenn die Trennung nicht erreicht wird, ist es jedoch kein Problem, insbesondere die „spezifischen Moleküle" in der Probe zu messen, wie später beschrieben wird.
Wenn eine „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften der spezifischen Moleküle zu ändern" welche an dem „spezifischen Molekül" in einer Probe bindet, alleine verwendet wird und nicht als eine komplexe Substanz der „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften der spezifischen Moleküle zu ändern" und einer „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet", bleibt die „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" noch übrig, weil die „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" im Überschuss verwendet wird. Jedoch kann die so zurückgehaltene Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet, zusammen mit den anderen Molekülen als „dem spezifischen Molekül" getrennt werden.
Eine zweite Ausführungsform, welche nicht zur vorliegenden Erfindung gehört (ein zweites Verfahren; nachfolgend manchmal als Ausführungsform ➁ abgekürzt) betrifft das Trennen von zwei oder mehreren Arten von Molekülen voneinander durch Platzieren einer Lösung, in welcher zwei oder mehrere Arten von Molekülen gelöst sind, unter ein ungleichförmiges elektrisches Feld mit einer elektrischen Feldstärke von 500 KV/m oder höher, wobei das Feld durch eine Elektrode gebildet wird, welche eine Struktur aufweist, die geeignet ist, ein ungleichförmiges elektrisches Feld zu bilden.
Im Folgenden wird dies im Detail beschrieben.
Eine elektrische Feldstärke von 500 KV/m oder höher erlaubt es, zwei oder mehrere Arten von Molekülen in einer Lösung voneinander zu trennen, welche in der Vergangenheit nicht voneinander getrennt worden sind. Eine geeignete elektrische Feldstärke eines ungleichförmigen elektrischen Feldes, welches von den oben beschriebenen Elektroden gebildet wird, sollte angemessen eingestellt werden, abhängig von der Art der zwei oder mehr Arten von Molekülen in einer Lösung, und obwohl es nicht verallgemeinert werden kann, wird sie angemessen in einem Bereich von 500 KV/m oder höher, vorzugsweise 500 KV/m bis 10 MV/m, besonders bevorzugt 500 KV/m bis 3,5 MV/m, ausgewählt. Höhere elektrische Feldstärken können Schwierigkeiten bei der Analyse wegen der Entwicklung von Wärme verursachen. Falls derartige E ventualitäten zu erwarten sind, kann z.B. eine geeignete Kühlung der Elektrodeneinheit durchgeführt werden.
In der vorliegenden Erfindung kann das anzulegende elektrische Feld sowohl ein Wechselstrom-Feld als auch ein Gleichstrom-Feld sein, und es ist im Allgemeinen bevorzugt, das Wechselstrom-Feld zu verwenden.
Wenn das zu messende Molekül insbesondere beispielsweise eine Nukleotidkette (Oligonukleotid, Polynukleotid) ein Chromosom und dergleichen ist, ist die elektrische Feldstärke 500 KV/m oder höher, vorzugsweise 500 KV m bis 10 MV/m, besonders bevorzugt 500 KV/m bis 3,5 MV/m. Wenn ein zu messendes Molekül beispielsweise eine Peptidkette, ein Protein und dergleichen ist, ist die elektrische Feldstärke 500 KV/m oder höher, vorzugsweise 1 MV/m bis 10 MV/m, besonders bevorzugt 1 MV/m bis 3,5 MV/m.
Die Frequenz des ungleichförmigen elektrischen Feldes ist gewöhnlich 100 Hz bis 10 MHz und besonders bevorzugt 1 kHz bis 10 MHz.
In dem Fall der Ausführungsform ➀ der vorliegenden Erfindung können zwei oder mehrere Arten von Molekülen bei einer niedrigeren elektrischen Feldstärke als 500 KV/m jeweils getrennt werden, da die Trennung wegen der Verwendung einer komplexen Substanz, enthaltend eine „Substanz, die fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", erleichtert ist. Jedoch ist es bevorzugt, die Trennung bei 500 KV/m oder höher durchzuführen, da die Trennung dadurch einfacher wird.
Zwei oder mehrere Arten von Molekülen in der Ausführungsform ➁ enthalten biologische Komponenten, wie beispielsweise Nukleotidketten (Oligonukleotidketten, Polynukleotidketten), Chromosomen, Peptidketten (zum Beispiel C-Peptid, Angiotensin I, oder dergleichen), Proteine (Serumproteine, wie beispielsweise Immunoglobulin A (IgA), Immunoglobulin E (IgE), Immunoglobulin G (IgG), β₂-Mikroglobulin, Albumin, und Ferritin; Enzymproteine wie beispielsweise Amylase, alkalische Phosphatase, und γ-Glutamyltransferase; antivirale Antikörper bis Viren, wie beispielsweise Rubel la-Virus, Herpes-Virus, Hepatitis-Virus, ATL-Virus, und AIDS-Virus und antigene Substanzen von diesen Viren; Antikörper bis verschiedene Allergene; Lipide, wie beispielsweise Lipoproteine; und Proteasen, wie beispielsweise Trypsin, Plasmin, Serin-Proteasen und dergleichen; Zuckerketten (zum Beispiel Zuckerketten von α-Fetoprotein, CA19-9, prostata-spezifisches Antigen, karzinoembryonisches Antigen, Substanzen, welche einzelne Zuckerketten aufweisen, hergestellt von Krebszellen); Lecitine (zum Beispiel Concanavalin A, Lens-Culinaris-Lecitin, Phaseolus-Vuigaris-Lecitin, Dutura-Stramonium-Lecitin, Weizenkeimlecitin und dergleichen), und dergleichen. In der Ausführungsform ➁ sind die zwei oder mehreren Arten von Molekülen solche, welche in einer Lösung lösbar sind, und in Ausführungsform ➀ der vorliegenden Erfindung verursachen die zwei oder mehreren Arten von Molekülen, welche unlöslich sind, kein Problem.
Gemäß Ausführungsform ➁ kann zwischen den oben genannten Molekülen die Trennung erreicht werden, wenn diese zwei oder mehrere Arten von Molekülen des selben Typs sind und ein Unterschiedliches Molekulargewicht aufweisen, oder zwei oder mehrere Arten von ganz unterschiedlichen Molekülen sind. Kombinationen von zwei oder mehreren Arten von Molekülen des selben Typs und mit einem unterschiedlichen Molekulargewicht umfassen zum Beispiel Kombinationen von Molekülen, welche ausgewählt sind von Nukleotidketten (Oligonukleotiden, Polynukleotiden) und Chromosomen und zum Beispiel Kombinationen von Molekülen, welche ausgewählt sind, von Peptidketten, Proteinen und dergleichen. Kombinationen von zwei oder mehreren Arten von ganz unterschiedlichen Molekülen umfassen zum Beispiel Kombinationen von Molekülen, welche ausgewählt sind von Nukleotidketten (Oligonukleotiden, Polynukleotiden) und Chromosomen mit Molekül(en), welche ausgewählt sind von Peptidketten und Proteinen, Kombinationen von Zuckern mit Molekül(en) ausgewählt von Gluciden, Peptidkette und Proteinen und Kombinationen von Zuckern mit Molekülen, ausgewählt von Peptidketten, Proteinen und Lecitinen, und dergleichen.
Oben beschriebene Lösungen, in welchen die zwei oder mehreren Arten von Molekülen gelöst werden, enthalten Proben, abgeleitet von einem lebenden Organismus, enthaltend Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Serum, Plasma, Cerebrospinalflüssigkeit, Synovialflüssigkeit und Lymphe, oder Exkrete, wie beispielsweise Urin und Fäzes, und behandelte Materialien davon. Behandelte Materialien umfassen zum Beispiel geeignete Lösungen von diesen Proben, abgeleitet von einem lebenden Organismus, mit Wasser, Puffern oder dergleichen, oder diese, erhalten aus der Rekonstitution durch geeignetes Lösen oder Suspendieren der oben genannten Moleküle von diesen körper-abgeleiteten Proben in Wasser, Puffern oder dergleichen. Bei der vorliegenden Erfindung enthalten Lösungen, in welchen zwei oder mehrere Arten von Molekülen gelöst werden, auch solche, welche Moleküle wie oben beschrieben enthalten, welche chemisch synthetisiert sind.
Puffer, welche eingesetzt werden können, enthalten Puffer, welche gewöhnlich im Stand der Technik eingesetzt werden, zum Beispiel Tris(Hydroxymethylaminomethan)-Puffer, Good's-Puffer, Phosphatpuffer, Boratpuffer, und dergleichen.
Wenn die vorher beschriebenen Lösungen eine hohe Leitfähigkeit aufweisen, bildet sich Joule-Wärme durch den Strom, welcher aufgrund der angelegten Spannung in der Lösung fließt, was dazu führt, dass die Lösung zum Kochen kommen kann. Daher ist es bevorzugt, dass die Lösungen mit einer geeigneten Einstellung verwendet werden, sodass die Leitfähigkeit gewöhnlich im Bereich von nicht mehr als 10 mS/cm, vorzugsweise nicht mehr als 200 μS/cm ist.
In der vorliegenden Erfindung ist eine Elektrode mit einer Struktur, die geeignet ist, ein horizontales und vertikales ungleichförmiges elektrisches Feld zu bilden, aus leitfähigem Material gemacht, wie beispielsweise Aluminium, Gold und dergleichen. Ihre Struktur kann irgendeine Struktur sein, die geeignet ist, dielektrophoretische Kräfte zu erzeugen, das heißt Bilden eines horizontalen und vertikalen ungleichförmigen elektrischen Feldes, einschließlich beispielsweise eine interdigitale Form [J. Phys. D: Appl. Phys. 258, 81–89 (1992); Biochim. Biophys. Acta., 964, 221–230 (1988), und dergleichen]. Wie in 2 gezeigt, sind insbesondere Formen eines Dreiecks, Quadrates, Trapezes, Sinuswelle oder Sägezahn oder dergleichen bevorzugt und Strukturen mit regelmäßigen und kontinuierlichen Anordnungen von diesen können möglich sein. Wenn die Elektrode für den Zweck des Sammelns eines spezifischen Moleküls verwendet wird, ist eine Elektrode mit einer Struktur mit solch einer regelmäßigen und sich kontinuierlich wiederholenden Anordnung bevorzugt.
Eine derartige Elektrode wird gewöhnlich durch Platzieren einer Elektrode mit einem oder mehreren Paaren der oben genannten Formen in einer Kamm-Zahn-Weise auf einem Substrat aus nicht leitenden Materialien, wie beispielsweise Glas, Quarz, Silikon und dergleichen, unter Verwendung von per se bekannter Mikroverarbeitungstechnologie [Biochem. Biophys. Acta., 964, 221–230, und dergleichen] hergestellt. Die Distanz zwischen angrenzenden (zugewandten) Elektroden ist nicht besonders spezifiziert wenn ein ungleichförmiges elektrisches Feld mit einer starken elektrischen Feldstärke gebildet werden kann, und obwohl es nicht verallgemeinert werden kann, sollte sie angemessen eingestellt werden, abhängig von der Art der zu messenden Moleküle. Beispielsweise im Falle von Peptidketten, Proteinen, und dergleichen ist die Distanz zwischen den breitesten Abständen in der Elektrode (minimale Lücke) gewöhnlich nicht mehr als 10 μm, vorzugsweise 5 μm, und im Fall von Nukleotidketten (Polynukleotiden, Oligonukleotiden) und dergleichen nicht mehr als 100 μm, vorzugsweise nicht mehr als 50 μm. Im Falle von Chromosomen ist die minimale Lücke gewöhnlich nicht mehr als 50 μm, vorzugsweise nicht mehr als 10 μm. Es sollte beachtet werden, dass, wenn die Distanz zwischen den angrenzenden (zugewandten) Elektroden relativ zu dem Molekül von Interesse zu groß ist, es unmöglich ist, ein ungleichförmiges elektrisches Feld mit einem genügenden elektrischen Feld zu bilden, und wenn die Distanz zu klein ist, kann es unmöglich sein, das betreffende Molekül zu fangen.
Das Trennungsverfahren gemäß Ausführungsform ➁ kann beispielsweise auf die folgenden Arten durchgeführt werden.
Verfahren A
Um zwei oder mehrere Arten von Molekülen zu trennen, welche in einer Lösung gelöst sind, durch Platzieren einer Lösung, in der zwei oder mehrere Arten von Molekülen gelöst sind unter einem ungleichförmigen elektrischen Feld, gebildet mit der oben beschriebenen Elektrode (Elektrodensubstrat), kann die Trennung durchgeführt werden aufgrund von Unterschieden in den Bewegungsarten der Moleküle, die unter einem ungleichförmigen elektrischen Feld durch Einstellen solch geeigneter Bedingungen existieren, dass das ungleichförmige elektrische Feld so gebildet ist, um nur das zu messende Molekül durch dielektrophoretische Kräfte zu bewegen (zum Beispiel nur das zu messende Molekül wandert zu einer bestimmten Position durch dielektrophoretische Kräfte und wird an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen, und die anderen Moleküle empfangen nicht genügend dielektrophoretische Kräfte und werden nicht an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen). Alternativ können Moleküle bei einer schwachen Position und einer starken Position in dem elektrischen Feld getrennt werden durch Einstellen solch geeigneter Bedingungen, dass das zu messende Molekül positive dielektrophoretische Kräfte empfängt und die anderen Moleküle negative dielektrophoretische Kräfte empfangen durch Einstellung der absoluten Dielektrizitätskonstante und Leitfähigkeit des Mediums und der Frequenz des angelegten elektrischen Feldes.
Verfahren B
Die Trennung kann durchgeführt werden, indem dem zu messenden Molekül ermöglicht wird, in das ungleichförmige elektrische Feld zu wandern, welches durch die Verwendung der Elektrode (Elektrodensubstrat), wie oben beschrieben, gebildet ist, und die dann ausnutzende Interaktion, hervorgerufen darin zwischen den dielektrophoretischen Kräften, welche den Molekülen durch das elektrische Feld zugefügt werden, und der Bewegung der Moleküle. In diesem Fall bewegen sich Moleküle, welche stärkere dielektrophoretische Kräfte empfangen, langsamer als solche, die schwache dielektrophoretische Kräfte empfangen, sodass es möglich ist, die Trennung der Moleküle einfacher zu gestalten.
Insbesondere wird ein Elektrodensubstrat eingesetzt, welches, wie in 3 gezeigt, die oben genannte Elektrode und solch eine Strombahn aufweist, dass eine Lösung, in welcher die zwei oder mehreren Arten von Molekülen gelöst sind, auf der Elektrode wandern können; und durch das Anlegen einer Spannung auf der Elektrode kann es einer Lösung, in welcher zwei oder mehrere Arten von Molekülen gelöst sind, ermöglicht werden, sich in einem ungleichförmigen elektrischen Feld zu bewegen, welches eine elektrische Feldstärke von 500 KV/m oder höher aufweist, gebildet durch die angelegte Spannung. In 3 zeigt der Pfeil die Flussrichtung einer Lösung an, in welcher zwei oder mehrere Arten von Molekülen gelöst sind.
Daher werden die Moleküle in einer Lösung in die Nähe einer Elektrode gezogen, welche ein stärkeres elektrisches Feld durch dielektrophoretische Kräfte auf der Elektrode aufweist. Die Bewegung der Moleküle wird durch drei Faktoren bestimmt: die dielektrophoretische Kraft F_d, den Widerstand aufgrund des Flusses in der Strombahn F_v, und die Kraft aufgrund der thermischen Bewegung F_th. ➀ In dem Fall von F_d >> F_v + F_th werden die Moleküle auf der Elektrode gefangen (trapped), ➁ im Falle von F_d << F_v + F_th werden die Moleküle durch den Fluss in der Strombahn hinauseluiert, ungeachtet des elektrischen Feldes. ➂ In dem Fall von F_d ÷ F_v + F_th werden die Moleküle hinab getragen mit sich wiederholender Adsorption und Desorption auf der Elektrode, so dass die Moleküle beim Auslass mit Verzögerung ankommen, relativ zu dem eingestellten Fluss in der Strombahn. Daher ist es, wenn die Trennung unter den Bedingungen wie im oben genannten Fall ➀ durchgeführt wird, möglich, zwei oder mehrere Arten von Molekülen voneinander zu trennen, da die Moleküle, welche große dielektrophoretische Kräfte empfangen, an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen werden und die anderen Moleküle nicht an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen werden und hinaus fließen. Wenn die Trennung unter den Bedingungen wie in dem oben genannten Fall ➂ durchgeführt wird, ist es möglich, zwei oder mehrere Arten von Molekülen voneinander zu trennen, da die Moleküle, welche größere dielektrophoretische Kräfte empfangen, mit einer geringeren Geschwindigkeit in der Strombahn wandern, als Moleküle, welche kleinere dielektrophoretische Kräfte empfangen.
In dem Verfahren B, welches oben beschrieben ist, kann eine Lösung, in welcher zwei oder mehrere Arten von Molekülen gelöst sind, bewegt werden, beispielsweise durch Verwendung eines physikalischen Mediums, welches mit einer Pumpe oder dergleichen fließt, oder durch elektroosmotisches Fließen.
Gemäß dem Trennungsverfahren nach Ausführungsform ➁ ist es möglich, das spezifische Molekül, welches zu messen ist, in einer Lösung zu sammeln, in welcher zwei oder mehrere Arten von Molekülen gelöst sind.
Daher können im Trennungsverfahren Verfahren A, wie vorher beschrieben, das spezifische Molekül oder die anderen Moleküle jeweils gesammelt werden, beispielsweise durch Trennen der zwei oder mehreren Arten von Molekülen voneinander auf solch eine Art und Weise, dass das spezifische Molekül an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen wird und die anderen Moleküle nicht an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen werden, anschließendes Waschen der Elektrode mit einem geeigneten Puffer, welcher gewöhnlich im Stand der Technik verwendet wird, Wasser oder dergleichen, während ein elektrisches Feld angelegt wird, und anschließendes Beenden des Anlegens des elektrischen Feldes, gefolgt vom Waschen der Elektrode mit einem geeigneten Puffer, welcher gewöhnlich im Stand der Technik eingesetzt wird, Wasser oder dergleichen.
Im Trennungsverfahren Verfahren B beispielsweise, wie vorher beschrieben, können, wenn die Trennung unter den oben beschriebenen Bedingungen ➀ durchgeführt wird, die spezifischen Moleküle oder die anderen Moleküle jeweils gesammelt werden durch Sammeln zunächst einer mobilen Phase, welche Moleküle enthält, welche kleine dielektrophoretische Kräfte empfangen und die sich ohne an einer bestimmten Position auf der Elektrode gefangen zu werden bewegen und danach durch Sammeln einer gewaschenen Lösung, welche Moleküle enthält, welche große die lektrophoretische Kräfte empfangen und welche an einer bestimmten Position auf der Elektrode während dem Anlegen des elektrischen Feldes gefangen worden sind, durch Ermöglichen solcher Moleküle, gegen den Auslass der Strombahn zu wandern durch Abbrechen des elektrischen Feldes, und Waschen der Elektrode mit einem geeigneten Puffer, welcher gewöhnlich im Stand der Technik verwendet wird, Wasser oder dergleichen. Wenn die Trennung unter der oben genannten Bedingung ➂ durchgeführt wird, können das spezifische Molekül oder die anderen Moleküle jeweils gesammelt werden durch Sammeln einer mobilen Phase am Auslass der Strombahn, welche Moleküle enthält, die kleine dielektrophoretische Kräfte empfangen, und anschließend einer mobile Phase, welche Moleküle enthält, die bei einer geringeren Geschwindigkeit wandern und größere dielektrophoretische Kräfte empfangen.
Das zu messende spezifische Molekül in einer Lösung kann gemessen werden durch Messen von irgendeinem der zwei oder mehreren Arten von Molekülen, die durch das Trennungsverfahren nach den Ausführungsformen ➀ und ➁ der vorliegenden Erfindung durch Verfahren gemäß den Eigenschaften des Moleküls getrennt wurden.
Zunächst wird die folgende Beschreibung gegeben, betreffend die Fälle, bei denen das Separationsverfahren von Ausführungsform ➀ der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird.
Eine Komponente (ein spezifisches Molekül [ein zu messendes Molekül] und/oder das andere Molekül als das spezifische Molekül) kann gemessen werden durch Trennen einer komplexen Substanz, resultierend aus der Interaktion zwischen dem „spezifischen Molekül" (einem zu messenden Molekül) und einer „Substanz, die fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", welches an dem spezifischen Molekül bindet, von den anderen Molekülen als dem spezifischen Molekül, enthaltend in der Probe, durch das Trennungsverfahren nach Ausführungsform ➀ der vorliegenden Erfindung, gefolgt von einem Messen des spe zifischen Moleküls (des zu messenden Moleküls) in der komplexen Substanz oder dem anderen Molekül als dem „spezifischen Molekül".
Bei dem oben genannten Verfahren ist das „spezifische Molekül" eines, welches selbst gemessen (detektiert) oder mit einer markierenden Substanz durch verschiedene Methoden markiert werden kann, oder alternativ eines, welches an einer „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" gebunden ist, welche selbst gemessen (detektiert) werden kann oder mit einer markierenden Substanz markiert werden kann. Die markierende Substanz, die „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" und das Markierungsverfahren sind unten beschrieben.
Ferner kann ein spezifisches Molekül (ein zu messendes Molekül) in einer Probe schnell und einfach gemessen werden durch Ausführung der Trennung einer komplexen Substanz (komplexe Substanz 1), welche durch das „spezifische Molekül" (das zu messende Molekül), die Substanz, welche an das spezifische Molekül bindet und eine „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", welche an dem spezifischen Molekül bindet, gebildet wird, von der (freien) Substanz, welche an das spezifische Molekül bindet, welches nicht in die Bildung der komplexen Substanz involviert ist (so genannte B/F-Trennung) durch das Trennungsverfahren der Ausführungsform ➀ der vorliegenden Erfindung, gefolgt vom Messen der komplexen Substanz 1, des spezifischen Moleküls (des zu messenden Moleküls) oder der Substanz, welche an dem spezifischen Molekül in der komplexen Substanz 1 bindet, oder der freien Substanz, welche an dem spezifischen Molekül, welches nicht in die Bildung der komplexen Substanz involviert ist, bindet.
In den oben erwähnten Verfahren wird als Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet, generell eine „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" verwendet, welche selbst gemessen (detektiert) oder bei einigen Verfahren mit einer markierenden Substanz markiert werden kann.
Außerdem wird bei dem Trennungsverfahren der Ausführungsform ➀ der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, die Trennung eines Komplexes des spezifischen Moleküls (des zu messenden Moleküls), einer Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder ein Molekül, welches an dem spezifischen Molekül bindet, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist), und einer „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" (eine komplexe Substanz 1), gebildet durch Reaktion des spezifischen Moleküls (des zu messenden Moleküls), einer Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder einem Molekül, welches an dem spezifischen Molekül bindet, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist) und einer „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", von der freien Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder die freie markierte Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet) ausgeführt. Danach ist es möglich, die Präsenz oder Absenz des spezifischen Moleküls (des zu messenden Moleküls) in einer Probe durch Detektieren der abgetrennten Substanz 1, basierend auf den Eigenschaften der Substanz, welche an dem spezifischen Molekül in der komplexen Substanz 1 bindet (oder der markierenden Substanz, welche an der Substanz bindet, welche an dem spezifischen Molekül innerhalb der komplexen Substanz 1 bindet) zu messen.
Darüber hinaus ist es möglich, nicht nur die Präsenz des spezifischen Moleküls (des zu messenden Moleküls) in einer Probe, sondern auch die Menge des spezifischen Moleküls (des zu messenden Moleküls) in einer Probe quantitativ, zum Beispiel gemäß den im Folgenden beschriebenen Methoden, zu messen.
Bei dem Trennungsverfahren der Ausführungsform ➀ der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, wird die Trennung einer komplexen Substanz des spezifischen Moleküls (des zu messenden Moleküls), einer Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder einer markierten Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist), und einer „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezi fischen Moleküls zu ändern" (einer komplexen Substanz 1), von der freien Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder der freien markierten Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist) ausgeführt. Danach ist es möglich, die Menge der Substanz, welche an dem spezifischen Molekül in der komplexen Substanz 1 bindet (oder die Menge der markierenden Substanz, welche an die Substanz gebunden ist, welche an dem spezifischen Molekül innerhalb der komplexen Substanz bindet) oder die Menge der freien Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder die Menge der markierenden Substanz, welche an die freie Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet, gebunden ist) durch Messverfahren gemäß den Eigenschaften der Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet oder die markierende Substanz zu messen, und demnach kann die Menge des spezifischen Moleküls (zu messenden Moleküls) in einer Probe bezogen auf die Menge gemessen werden.
Alternativ kann das spezifische Molekül in einer Probe durch so genannte Kompetitiv-Verfahren, bei welchen ein markiertes spezifisches Molekül für kompetitive Reaktionen zwischen dem markierten spezifischen Molekül und dem spezifischen Molekül in der Probe zum Einsatz kommt, gemessen werden.
Folglich ist es möglich, dass durch Kontaktieren einer Probe, welche das spezifische Molekül beinhaltet, mit dem spezifischen Molekül, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist (das markierte spezifische Molekül) und der „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", eine Mischung aus einer markierten komplexen Substanz des markierten spezifischen Moleküls und der „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", und eine komplexe Substanz des spezifischen Moleküls und der „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" ausgebildet werden, und die Mischung Dielektrophorese unterworfen wird, um die komplexe Substanz, welche das markierte spezifische Molekül enthält, von dem freien markierten spezifischen Molekül zu trennen und die Menge der markierenden Substanz, welche an das markierte spezifische Molekül in der separierten markierten komplexen Substanz gebunden ist oder die Menge der markierenden Substanz, welche an das freie markierte spezifische Molekül gebunden ist, wird bestimmt durch Messverfahren gemäß den Eigenschaften der markierenden Substanz, und die Menge des spezifischen Moleküls in einer Probe wird bestimmt basierend auf der erhaltenen Menge.
Bei diesen oben genannten Verfahren kann, um die Menge des spezifischen Moleküls in einer Probe, basierend auf der erhaltenen Menge des spezifischen Moleküls, der Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet oder der markierenden Substanz zu bestimmen, die Menge des spezifischen Moleküls in einer Probe berechnet werden, zum Beispiel, unter Verwendung entsprechender Eichkurven, welche das Verhältnis zwischen der Menge des spezifischen Moleküls und der Menge der markierenden Substanz in der komplexen Substanz, der Menge der Substanz, welche an dem spezifischen Molekül in der komplexen Substanz bindet (oder der Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet, welches durch eine markierende Substanz markiert ist), der Menge der markierenden Substanz des freien markierten spezifischen Moleküls oder der Menge der freien Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder der markierenden Substanz in der markierten Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet, welches durch eine markierende Substanz markiert ist), aufzeigen. Die Eichkurven werden durch Ausführung von Messverfahren in einer ähnlichen Art und Weise mit Proben, welche bekannte Konzentrationen des spezifischen Moleküls enthalten, erhalten.
Ferner kann eine relative Menge des spezifischen Moleküls in einer Probe berechnet werden und ein Fehler, welcher zwischen den Dielektrophorese-Trennungs-Vorrichtungen gefunden wird, kann ebenfalls verbunden werden, zum Beispiel durch Hinzufügen einer bekannten Konzentration einer nachweisbaren Substanz als interner Standard zu einer Probe, und durch Vergleich einer Menge des internen Standards mit einer Menge der markierenden Substanz oder der Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder der markierten Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet) in einer resultierenden komplexen Substanz, oder einer Menge der markierenden Substanz in dem freien markierten spezifischen Molekül oder der freien Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder der markierenden Substanz in der freien markierten Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet).
Bei dem oben genannten Verfahren ist die nachweisbare Substanz eine Substanz, welche selbst gemessen (detektiert) werden kann oder bei einigen Verfahren mit einer markierenden Substanz markiert wird. Zum Beispiel enthält die nachweisbare Substanz das konkrete Beispiel wie das oben genannte spezifische Molekül und die trennungsverbessernde Substanz, vorausgesetzt, dass es ein anderes ist, als die Komponente, enthalten in der Probe und dass es nicht an dem zu messenden Molekül bindet. Die markierende Substanz und das Markierungsverfahren sind die gleichen wie oben beschrieben.
Die folgende Beschreibung bezieht sich nun auf die Fälle, bei welchen das Trennungsverfahren der Ausführungsform ➁ der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommt.
Das zu messende Molekül (Molekül A) kann bei Messverfahren, welche bei dem Trennungsverfahren der Ausführungsform ➁ der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen, jedes sein, welches Gegenstand der Trennung, wie oben beschrieben, ist, und in einer Lösung, wie oben beschrieben, löslich ist, worin ➀ ein Molekül existiert, welches fähig ist, wechselseitig mit dem Molekül A zu interagieren, um eine komplexe Substanz (ein Molekül B) auszubilden, das Molekül B, welches Eigenschaften besitzt, welche es befähigen, selbst durch einige Verfahren gemessen (detektiert) zu werden oder fähig zu sein, mit einer markierenden Substanz markiert zu werden; oder ➁ das Molekül A kann mit einer markierenden Substanz markiert werden und es existiert ein Molekül, welches fähig ist, wechselseitig mit dem Molekül A zu interagieren, um eine markierte komplexe Substanz (ein Molekül B) auszubilden.
Daher kann das Molekül A in einer Probe schnell und einfach gemessen werden durch Ausführung der Trennung einer komplexen Substanz, welche durch die Interaktion zwischen dem zu messenden Molekül (dem Molekül A) und einer Substanz, welche spezifisch an dem zu messenden Molekül bindet (dem Molekül B) (komplexe Substanz 2), entsteht – so genannte B/F-Trennung – durch das Trennungsverfahren der Ausführungsform ➁ der vorliegenden Erfindung, und anschließendem Messen der komplexen Substanz 2, des Moleküls A oder des Moleküls B in der komplexen Substanz 2 (oder der markierenden Substanz, welche an as Molekül B in der komplexen Substanz 2 gebunden ist), oder des freien Moleküls B (oder der markierenden Substanz, welche an das freie Molekül B gebunden ist).
Eine Probe, welche das Molekül A enthält, reagiert nämlich mit dem Molekül B (oder dem Molekül B, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist [ein markiertes Molekül B]), und die resultierende komplexe Substanz 2 des Moleküls A und des Moleküls B (oder des markierten Moleküls B) wird von dem freien Molekül B (oder dem markierten Molekül B) durch das Trennungsverfahren der Ausführungsform ➁ der vorliegenden Erfindung getrennt. Danach kann die Präsenz oder Absenz des Moleküls A in einer Probe durch Detektieren der abgetrennten komplexen Substanz 2 gemessen werden, basierend auf den Eigenschaften des Moleküls B in der komplexen Substanz (oder der markierenden Substanz, welche an das Molekül B innerhalb der komplexen Substanz gebunden ist).
Darüber hinaus ist es möglich, nicht nur die Präsenz des Moleküls A in einer Probe zu messen, sondern auch die Menge des Moleküls A in einer Probe quantitativ, zum Beispiel gemäß dem folgenden Verfahren, zu bestimmen.
Das heißt, dass eine Probe, welche das Molekül A enthält, mit dem Molekül B (oder dem Molekül B, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist [ein markiertes Molekül B]) reagiert, und die daraus resultierende komplexe Substanz 2 des Moleküls A und des Moleküls B (oder des markierten Moleküls B) von dem freien Molekül B (oder dem freien markierten Molekül B) durch ein Trennungsverfahren der Ausfüh rungsform ➁ der vorliegenden Erfindung getrennt wird. Danach ist es möglich, die Menge des Moleküls B in der abgetrennten komplexen Substanz 2 (der markierenden Substanz, welche in der abgetrennten komplexen Substanz 2 an das Molekül B gebunden ist), oder die Menge des freien Moleküls B (oder der markierenden Substanz, welche an das freie markierte Molekül B gebunden ist) durch Messverfahren gemäß den Eigenschaften des Moleküls B oder der markierenden Substanz zu messen, und folglich wird die Menge des Moleküls A in der Probe basierend auf der erhaltenen Menge gemessen.
Alternativ kann das Molekül A in einer Probe durch so genannte kompetitive Verfahren, bei welchen ein markiertes Molekül A für Konkurrenz- Reaktionen zwischen dem markierten Molekül A und dem Molekül A in der Probe zum Einsatz kommt, gemessen werden.
Daher reagieren eine Probe, welche ein Molekül A enthält, das Molekül A, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist (das markierte Molekül A), und ein Molekül B miteinander, um eine markierte komplexe Substanz des markierten Moleküls A und des markierten Moleküls B und eine komplexe Substanz des Moleküls A und des Moleküls B zu bilden, und dann wird die markierte komplexe Substanz von dem freien markierten zu messenden spezifischen Molekül A durch ein Trennungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, getrennt. Danach ist es möglich, die Menge der markierenden Substanz, welche an das markierte Molekül A gebunden ist, innerhalb der abgetrennten markierten komplexen Substanz oder die Menge der markierenden Substanz, welche an das freie, markierte Molekül A gebunden ist, durch Messverfahren gemäß den Eigenschaften der markierenden Substanz zu messen, und folglich wird die Menge des Moleküls A in der Probe basierend auf der erhaltenen Menge gemessen.
Bei diesen oben genannten Verfahren kann die Menge des Moleküls A in einer Probe berechnet werden, um die Menge des Moleküls A in einer Probe, basierend auf den resultierenden Mengen des Moleküls A, oder der markierenden Substanz zu bestimmen, zum Beispiel durch Verwendung entsprechender Eichkurven, welche das Verhältnis zwischen den Mengen des Moleküls A und den Mengen der markierenden Substanz in der markierenden komplexen Substanz, den Mengen des Moleküls B (oder der markierenden Substanz) in einer komplexen Substanz, den Mengen der markierenden Substanz in dem freien markierten Molekül A, oder den Mengen des freien Moleküls B (oder der markierenden Substanz in dem markierten Molekül B) aufzeigen. Die Eichkurve, wird durch Ausführung von Messungen in einer ähnlichen Art und Weise mit Proben erhalten, welche bekannte Konzentrationen des Moleküls A beinhalten.
Ferner kann eine relative Menge des spezifischen Moleküls in einer Probe berechnet werden und ein Fehler, welcher zwischen den Dielektrophorese-Trennungs-Vorrichtungen gefunden wird, kann ebenfalls verbunden werden zum Beispiel durch Hinzufügen einer bekannten Konzentration einer nachweisbaren Substanz als interner Standard zu einer Probe, und durch Vergleich einer Menge des internen Standards mit einer Menge der markierenden Substanz oder des Moleküls B (oder der markierten Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet) in einer resulierenden komplexen Substanz, oder einer Menge der markierenden Substanz in dem freien markierten Molekül A oder dem freien Molekül B (oder der markierenden Substanz in dem freien markierten Molekül B).
Bei der oben genannten Methode ist die nachweisbare Substanz eine, welche selbst gemessen (detektiert) werden kann oder bei einigen Verfahren mit einer markierenden Substanz markiert werden kann. Zum Beispiel beinhaltet die nachweisbare Substanz das konkrete Beispiel, wie das oben genannte spezifische Molekül, und die trennungsverbessernde Substanz, vorausgesetzt, dass es ein anderes ist als die in der Probe beinhaltete Komponente in der Probe und dass es nicht an dem zu messenden Molekül binden kann. Die markierende Substanz und das Markierungsverfahren sind die gleichen wie oben beschrieben.
Bei den oben genannten Verfahren ist das Molekül, welches spezifisch an dem Molekül A (Molekül B) bindet, das gleiche, wie die „Substanz, welche spezifisch an dem spezifischen Molekül bindet", wie zuvor beschrieben.
Markierende Substanzen, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind irgendwelche Substanzen, welche gewöhnlich bei solchen Verfahren, wie Enzym-Immunoessay (EIA), Radio-Immunoessay (RIA), Fluoro-Immunoessay (FIA), Hybridisierungsmethoden und dergleichen eingesetzt werden, und sie dienen als Beispiel für Enzyme wie beispielsweise alkalische Phosphatase (ALP), β-Galaktosidase (β-Gal), Peroxidase (POD), Mikroperoxidase, Glucoseoxidase (GOD), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH), Malatdehydrogenase und Luciferase; Farbstoffe, wie beispielsweise Coomassie Brilliant Blue R250 und Methylorange; Radioisotope, wie beispielsweise ^99mTc, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹⁴C, ³H, ³²P und ³⁵S; fluoreszierende Substanzen, wie beispielsweise Fluorescein, Rhodamin, Dansyl, Fluorescamin, Cumarin, Naphtylamine oder deren Derivate und Europium (Eu); lumineszierende Substanzen wie beispielsweise Luciferin, Isoluminol, Luminol und Bis(2,4,6-trifluorophenyl)-oxalat; Substanzen, welche Absorption im ultravioletten Bereich aufweisen, wie beispielsweise Phenol, Naphtol, Anthracen und deren Derivate; Substanzen, welche Eigenschaften als Spin-Labeling-Mittel aufweisen, veranschaulicht durch Komponenten mit Oxyl-Gruppen, wie beispielsweise 4-Amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, 3-Amino-2,2,5,5-tetramethylpyrroridin-1-oxyl und 2,6-Di-t-butyl-α-(3,5-di-t-butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-yliden)-p-tolyloxyl und ähnliches.
Das Markieren eines Moleküls A oder eines Moleküls B mit einer markierenden Substanz kann durchgeführt werden durch irgend eine herkömmliche Methode aus dem Stand der Technik, wie beispielsweise bekannte Markierungsverfahren, die gewöhnlich eingesetzt werden in EIA, RIA, FIA, Hybridisierung oder dergleichen, welche per se bekannt sind [zum Beispiel Ikagaku Zikken Koza (Methods in Medical an Chemical Experiments) vol. 8, herausgegeben von Y. Yamamura, erst ed., Nakayama-Shoten, 1971; A. Kuwao, Illustrative Fluorescent Antibodies, erste ed., Softscience Inc., 1983; Enzyme Immunoassy, herausgegeben von E. Ishikawa, T. Kawai, und K. Miyai, dritte ed., Igaku-Shoin, 1987; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite ed., J. Sambrook, E. F. Fritsch, und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press und dergleichen] und herkömmliche Verfahren, bei denen eine Reaktion von Avidin (oder Streptavidin) und Biotin eingesetzt wird.
Bei dem Messverfahren der vorliegenden Erfindung (dem zweiten Verfahren, Ausführungsform ➁) können Bedingungen zur Reaktion eines Moleküls A und eines Moleküls B (oder eines markierten Moleküls B) zur Ausbildung einer komplexen Substanz 2, oder Reaktion eines Moleküls A (oder des markierten Moleküls A) und eines Moleküls B zur Ausbildung einer markierten komplexen Substanz solche Bedingungen sein, bei welchen die Ausbildung der komplexen Substanz 2 (oder der markierten komplexen Substanz) nicht gehemmt ist. Folglich können solche Reaktionen ausgeführt werden zum Beispiel, gemäß den gewöhnlichen Verfahren, wie beispielsweise Reaktionsbedingungen zur Ausbildung der komplexen Substanz 2 (oder der markierten komplexen Substanz) bei EIA, RIA, FIA, Hybridisierungsverfahren, oder dergleichen, welche per se bekannt sind. Außerdem können bei dem ersten Verfahren der vorliegenden Erfindung Reaktionsbedingungen zur Ausbildung einer komplexen Substanz 1 eines spezifischen Moleküls (des markierten spezifischen Moleküls), einer Substanz, welche an das spezifische Molekül bindet, und einer „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften zu ändern" [oder des spezifischen Materials (des markierten spezifischen Moleküls) und „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften zu ändern"] oder einer markierten komplexen Substanz des markierten spezifischen Moleküls, einer Substanz, welche an das spezifische Molekül bindet, und einer „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften zu ändern" solche, entsprechend den oben genannten Reaktionsbedingungen sein.
Bei dem Verfahren der Ausführungsform ➁ der vorliegenden Erfindung (dem zweiten Verfahren) kann die Konzentration des Moleküles B (oder des markierten Moleküls B), welche bei Reaktion des Moleküls A und des Moleküls B (oder des markierten Moleküls B) zur Ausbildung einer komplexen Substanz verwendet wird, aufgrund des Variierens gemäß der Detektionsgrenze des Moleküls A und dergleichen nicht verallgemeinert werden, und es wird bevorzugt, dass das Molekül B (oder das markierte Molekül B) gewöhnlich in Reaktionslösungen mit einer Konzentration vorhanden ist, die es erlaubt an allen Molekülen A, entsprechend der gegebenen Detektionsgrenzen-Konzentration zu binden, vorzugsweise einer über zweimal so hohen Konzentration, besonders bevorzugt einer über fünfmal so hohen Konzentration vorhanden ist. Auch kann die Konzentration des „spezifischen Moleküls" und der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" (oder der markierten „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet") oder der „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" gemäß diesen Bedingungen bestimmt werden, um bei dem Verfahren der Ausführungsform ➀ der vorliegenden Erfindung (dem ersten Verfahren) verwendet zu werden.
Bei dem Verfahren der Ausführungsform ➁ (dem zweiten Verfahren) kann die Konzentration des markierten Moleküls A und des Moleküls B, welche bei der Reaktion des Moleküls A, des markierten Moleküls A, und des Moleküls B zur Bildung einer markierten komplexen Substanz verwendet wird, soweit erforderlich, bestimmt werden, abhängig davon, auf welches Level die Detektionsgrenze des Moleküls A und die Messempfindlichkeit und dergleichen bestimmt sind. Die Konzentration des markierten Moleküls A, welche verwendet wird, ist mindestens mehr als eine Konzentration, welche erlaubt ist, um an allen Molekülen B, welche in der Reaktionslösung vorhanden sind, zu binden. Folglich kann die Konzentration des „markierten spezifischen Moleküls„ und der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" (oder der markierten „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet"), verwendet in dem Verfahren der Ausführungsform ➀ der vorliegenden Erfindung (der ersten Methode), gemäß diesen Bedingungen bestimmt werden.
Bei dem Verfahren der Ausführungsform ➁ (dem zweiten Verfahren) kann der Reaktions-pH-Wert und die Temperatur, welche aufgrund des Variierens – abhängig von den Eigenschaften des Moleküls A und des Moleküls B – nicht verallgemeinert werden kann, in dem Bereich liegen, in welchem die Bildung der komplexen Substanz 2 (oder der markierten komplexen Substanz) nicht gehemmt ist. Der pH-Wert liegt gewöhnlich in einem Bereich von 2 bis 10, vorzugsweise 5 bis 9, und die Temperatur liegt gewöhnlich im Bereich von 0 bis 90°C, vorzugsweise 20 bis 80°C. Bei der Reaktionszeit ist die für die Ausgestaltung einer komplexen Substanz 2 (oder der markierten komplexen Substanz) erforderliche Zeit unterschiedlich, abhängig von den Eigenschaften des Moleküls A und des Moleküls B, und die Reaktion kann, soweit erforderlich, für gewöhnlich für die Dauer von ein paar Sekunden bis zu ein paar Stunden ausgeführt werden. Auch kann der ph-Wert, die Temperatur und die Reaktionszeit des Verfahrens der Ausführungsform ➀ der vorliegenden Erfindung (des ersten Verfahrens) gemäß diesen Konditionen angepasst werden.
Bei den Messverfahren der vorliegenden Erfindung können Messungen durch entsprechende, vorher festgelegte Verfahren, gemäß der Art der Analyten, durchgeführt werden, um das Molekül B in der abgetrennten komplexen Substanz 2 (oder der markierenden Substanz, welche in der komplexen Substanz 2 an das Molekül B gebunden ist), das freie Molekül B (oder die markierende Substanz, welche an das freie, markierte Molekül B gebunden ist), die Substanz, welche in der komplexen Substanz 1 an das spezifische Molekül bindet (oder die markierende Substanz, welche an die Substanz gebunden ist, welche an das spezifische Molekül in der komplexen Substanz 1 bindet), die freie Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder die freie Substanz, welche an das mit einer markierenden Substanz markierte spezifische Molekül bindet), die markierende Substanz, welche an das markierte Molekül A in der markierten komplexen Substanz gebunden ist, die markierende Substanz, welche an dem markierten Molekül A bindet, die markierende Substanz, welche an dem markierten spezifischen Molekül in einer markierten komplexen Substanz bindet, oder die markierende Substanz, welche an dem freien markierten spezifischen Molekül bindet, zu messen. Falls zum Beispiel Enzymaktivitäten vorliegen, können Messungen gemäß den gewöhnlichen Verfahren, wie beispielsweise EIA und Hybridisierungsverfahren, wie beispielsweise Verfahren, wie sie in Enzym-Immunoessays (Proteine, Nukleotidsäuren, und Enzyme, Extra issue Nr. 31, herausgegeben von T. Kitagawa, T. Nambara, A. Tsuzi, und E. Ishikawa, S. 51–63, Kyoritsu Publishing Inc., herausgegeben am 10. September 1987) und dergleichen beschrieben werden, ausgeführt werden. Falls die zu messenden Substanzen radioaktiv sind, können die Messungen durch Selektion von entsprechenden Messinstrumenten, wie beispielsweise Immersions-GM-Zähler, flüssigem Szintillations-Zähler, „well-type" Szintillations-Zähler, oder dergleichen ausgeführt werden, abhängig von der Art und der Stärke der radioaktiven Strahlung, welche von den radioaktiven Substanzen ausgestrahlt wird, gemäß den gewöhnlichen Verfahren, wie beispielsweise RIA und Hybridisierungsverfahren (siehe, zum Beispiel, Methods in Medical and Chemical Experiments, vol. 8, herausgegeben von Y. Yamamura, erste Ausgabe, Nakayama-Shoten, 1971; Methods in Biochemical Experiments 2: Tracer Experiments Teil II, S. Takemura und T. Honzyo, S. 501–525, Tokyo Kagaku Dozin, Inc., veröffentlicht am 25. Februar 1977). Falls deren Eigenschaften fluoreszierend sind, können Messungen gemäß gewöhnlicher Verfahren, wie beispielsweise FIA und Hybridisierungsverfahren ausgeführt werden, unter Einsatz von Messinstrumenten, wie beispielsweise Fluorezenz-Belichtungsmessern, konfokaler Fluoreszenzmikroskope, oder dergleichen, zum Beispiel Verfahren, wie in Illustrative Fluorescent Antibodies (A. Kuwao, erste Ausgabe, Softscience Inc., 1983), Methods in Biochemical Experiments 2: Chemistry of Nucleidc Acids III, M. Miyoshi, S. 299–318, Tokyo Kagaku Dozin, Inc., veröffentlicht am 15. Dezember 1977), und dergleichen beschrieben. Falls deren Eigenschaften lumineszierend sind, können Messungen gemäß gewöhnlicher Verfahren unter Einsatz von Messinstrumenten wie beispielsweise Photonenzählern ausgeführt werden, zum Beispiel, Verfahren wie in Enzyme Immunoassays (Proteine, Nukleotidsäuren, und Enzyme, Extra issue Nr. 31), herausgegeben von T. Kitagawa, T. Nambara, A. Tsuzi, und E. Ishikawa, S. 252–263, Kyoritsu Publishing Inc., veröffentlicht am 10. September 1987) und dergleichen, beschrieben. Falls deren Eigenschaften solche sind, welche Absorption im ultravioletten Bereich besitzen, können Messungen durch gewöhnliche Verfahren unter Einsatz von Messinstrumenten ausgeführt werden, wie beispielsweise Spektralbelichtungsmessern, und falls deren Eigenschaften chromogen sind, können Messungen durch gewöhnliche Verfahren unter Einsatz von Messinstrumenten wie beispielsweise Spektralbelichtungsmessern und Mikroskopen ausgeführt werden. Falls deren Eigenschaften Spineigenschaften sind, können Messungen gemäß Verfahren ausgeführt werden, bei welchen Elektronenspinresonanzinstrumente zum Einsatz kommen, wie zum Beispiel Verfahren wie in Enzyme Immunoassays (Proteine, Nukleotidsäuren, und Enzyme, Extra issue Nr. 31), herausgegeben von T. Kitagawa, T. Nambara, A. Tsuzi, und E. Ishikawa, S. 264–271, Kyoritsu Publishing Inc., veröffentlicht am 10. September 1987), und dergleichen.
Bei den Messverfahren der vorliegenden Erfindung zur Messung entsprechender Moleküle, welche durch Trennungsverfahren gemäß vorliegender Erfindung, wie oben beschrieben, abgetrennt wurden, können die Messungen zum Beispiel durch Messen, ob das komplexe Molekül oder die komplexe Substanz und/oder das freie Molekül B oder die freie „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" von einer bestimmten Position auf der Elektrode (einer starken und/oder einer schwachen elektrischen Feldregion) getrennt oder gefangen sind durch direkte Beobachtung des Moleküls B in der komplexen Substanz 2 (oder der markierenden Substanz, welche an dem Molekül B in der komplexen Substanz 2 gebunden ist), des freien Moleküls B (oder der markierenden Substanz, welche an das freie markierte Molekül B gebunden ist), der Substanz, welche an das spezifische Molekül in der komplexen Substanz 1 bindet (oder der markierenden Substanz, welche an der Substanz gebunden ist, welche an dem spezifischen Molekül in der komplexen Substanz 1 bindet) oder der freien Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder der freien markierten Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet), ausgeführt werden. In diesem Fall ist es wünschenswert, dass das Molekül B, das spezifische Molekül, oder die markierende Substanz radioaktive, fluoreszierende, lumineszierende, chromogene, drehende Eigenschaften oder dergleichen aufweisen.
Eine eluierende Lösung des Elektrodensubstrats, wie oben beschrieben, kann direkt zu einer Detektionseinheit geführt werden, worin das Molekül B in der komplexen Substanz 2 (oder der markierenden Substanz, welche an das Molekül B in der komplexen Substanz 2 gebunden ist) in der eluierenden Lösung, das freie Molekül B (oder die markierende Substanz, welche an das freie markierte Molekül B gebunden ist) in der eluierenden Lösung, die Substanz, welche an das spezifische Molekül in der komplexen Substanz 1 bindet (oder die markierte Substanz, welche an die Substanz gebunden ist, welche an das spezifische Molekül in der komplexen Substanz 1 bindet) in der eluierenden Lösung, die freie Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet (oder die freie markierte Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet) in der eluierenden Lösung, der markierenden Substanz, welche an dem markierten Molekül A in der markierten komplexen Substanz in der eluierenden Lösung gebunden ist, der markierten Substanz, welche an dem markierten freien Molekül A in der eluierenden Lösung gebunden ist, der markierten Substanz, welche an das markierte spezifische Molekül in der markierten komplexen Substanz in der eluierenden Lösung gebunden ist, oder der markierenden Substanz, welche an das freie markierte spezifische Molekül in der eluierenden Lösung gebunden ist, direkt gemessen werden kann. Alternativ zu der oben genannten, kann eine ähnliche Messung unter Verwendung der Elektrode, ausgestattet mit einer Detektionseinheit, ausgeführt werden. Bei Verwendung solcher wie oben genannter Verfahren, können Messungen rascher ausgeführt werden.
Für den Fall, dass Enzymaktivitäten die Eigenschaften sind, welche bei einigen Verfahren nachweisbar sind und welche das Molekül B, die Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet, das spezifische Molekül oder die markierende Substanz aufweisen, ist es erforderlich, eine Reaktionseinheit zwischen dem stromabwärtigen Ende der Elektrode auf dem Substrat und der Detektionseinheit anzubieten, an welchen Reagenzien zur Messung der Enzymaktivitäten bereitgestelt werden, um die Reaktion mit einer eluierenden Lösung durchzuführen. Die Reagenzien zur Messung der Enzymaktivitäten, welche in der Reaktionseinheit verwendet werden, können solche sein, welche gemäß den Verfahren, welche in Enzyme Immunoassays (Proteine, Nukleotidsäuren, und Enzyme, Extra issue Nr. 31, herausgegeben von T. Kitagawa, T. Nambara, A. Tsuzi, und E. Ishikawa, S. 51–63, Kyoritsu Publishing Inc., veröffentlicht am 10. September 1987) und dergleichen beschrieben werden, hergestellt werden, oder Reagenzien kommerziell erhältlicher Kits, welche für klinische Tests zum Einsatz kommen, können entsprechend dieser Verwendung ausgewählt werden. Au ßerdem ist es für den Fall, bei welchem die Eigenschaften des Moleküls B oder der markierenden Substanz keine Enzymaktivitäten sind, freigestellt, eine passende Reaktionseinheit zwischen dem stromabwärtigen Ende der Elektrode auf dem Substrat und der Detektionseinheit anzubieten, an welchen vorher festgelegte Reagenzien aufgebraucht werden, um für den Zweck der Erhöhung der Detektionssensitivität und dergleichen zu reagieren.
Zwischen den zwei Messverfahren bei dem letzteren Verfahren, das heißt, dem Verfahren, bei welchem entsprechende Moleküle nach Trennung auf der Elektrode zu der Detektionseinheit geführt werden, ist es wahrscheinlich, dass die Effizienz der Trennung reduziert wird, oder die Detektionssensitivität der Moleküle, welche getrennt wurde, reduziert ist, aufgrund der Einflüsse beispielweise der Flussrate der Eluierungslösung von jedem Molekül während des Bewegens zu der Detektionseinheit, und dergleichen. Deshalb ist, falls nur ein spezifisches Molekül zur Detektion bestimmt ist, das vorherige Verfahren, das heißt, das Verfahren, bei welchem die entsprechenden getrennten Moleküle durch direkte Beobachtung der Oberfläche der Elektrode nach der Trennung auf der Elektrode detektiert werden, von Vorteil, zum Beispiel weil dieses Verfahren verschiedene Probleme, welche aus Einflüssen aufgrund der Diffusion resultieren, überwinden kann, zum Beispiel wie oben beschrieben, und zusätzlich kann die von der Trennung zur Detektion erforderliche Zeit durch dieses Verfahren reduziert werden, da es keinen Anlass gibt, die entsprechenden getrennten Moleküle zur Detektionseinheit zu führen. Ebenso ist dieses Verfahren von Vorteil da dieses Verfahren z.B. dazu führt, den Raum des Substrats zu reduzieren, da die Reaktion, Trennung und Detektion auf dem Elektrodensubstrat ausgeführt werden, und daher die Reaktions-, Trennungs- und Detektionseinheiten integriert werden können, und ferner erwartet werden kann, einen Detektionsapparat selbst zu miniaturisieren, da die Speisung einer eluierende Lösung nicht erforderlich ist.
Die Messverfahren der vorliegenden Erfindung können gemäß den bekannten Verfahren per se wie oben beschrieben ausgeführt werden, mit Ausnahme des Einsatzes der Trennungsverfahren der vorliegenden Erfindung, und verwendete Reagen zien können, soweit erforderlich, ebenfalls gemäß den per se bekannten Verfahren ausgewählt werden.
Es ist von Vorteil, die oben genannten Verfahren der vorliegenden Erfindung auszuführen, um einen dielektrophoretisches Messungs-Kit umfassend Reagenzien und die anderen für die Verwendung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung, herzustellen.
Der dielektrophoretische Messungs-Kit der vorliegenden Erfindung umfasst speziell eine „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" und eine „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", worin diese Substanzen eine komplexe Substanz mit dem „spezifischen Molekül" in einer Probe bilden können.
Alternativ umfasst der dielektrophoretische Messungs-Kit der vorliegenden Erfindung das „spezifische Molekül, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist", eine „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet", und eine „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", worin diese Substanz eine komplexe Substanz mit dem „spezifischen Molekül" in einer Probe oder dem „spezifischen Molekül, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist" ausbilden kann.
Bei den oben erwähnten Kits sind vorzuziehende Ausführungsformen und spezifische Beispiele der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet", der „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", und des „spezifische Moleküls, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist" wie oben beschrieben, und die „Substanz, welche fähig ist, die dielektrophoretischen Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern" ist bevorzugt eine Substanz, welche an einem von beiden oder an beiden „spezifischen Molekülen" und der „Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet" bindet. Die oben erwähnten Kits können ferner mit einer dielektrophoretischen Vorrichtung kombiniert werden.
Darüber hinaus können die Kits auch Reagenzien, welche im Stand der Technik wie oben beschrieben verwendet werden, Standards des spezifischen Moleküls oder das Moleküls A und dergleichen umfassen.
Das Folgende wird die Messverfahren der vorliegenden Erfindung im weiteren Detail beschreiben durch ein Beispiel für den Fall des Einsatzes eines Hybridisierungs-Verfahrens zur Detektion einer spezifischen Gen-Sequenz.
Zuerst werden eine Nukleotid-Probe, welche eine adäquate Länge aufweist, welche eine Sequenz komplementär zu der zu detektierenden (oder zu messenden) Gen-Sequenz aufweist und mit einer markierenden Substanz markiert worden ist, und unbekannte Gene, welche denaturiert sind zu dem Einzelstrang gemischt und in einem entsprechenden Puffer zur Reaktion gebracht und weichgeglüht, um einen Komplex der Nukleotid-Probe und der unbekannten Gene, welche zu dem Einzelstrang denaturiert sind, zu bilden. Dann wird die resultierende Reaktionslösung für das Trennungsverfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von dielektrophoretischen Kräften, wie oben beschrieben, beansprucht, um den Komplex von der Nukleotid-Probe zu trennen. Nach der Trennung wird die markierende Substanz in dem Komplex durch Verfahren, wie oben beschrieben, gemessen, so dass es möglich ist, zu detektieren oder zu messen, ob die unbekannten Gene die Sequenz enthalten, welche komplementär zu der Nukleotid-Probe ist, das heisst, die Präsenz oder Absenz der Sequenz, welche komplementär zu der Nukleotid-Probe ist.
Bei den oben erwähnten Verfahren können die Nukleotid-Probe und Puffer gemäß den per se bekannten Verfahren entsprechend ausgewählt werden. Verfahren zur Vorbereitung einer Nukleotid-Probe und unbekannter Gene, welche an einem Einzelstrang denaturiert wurde, Glühbedingungen, und dergleichen können gemäß den per se bekannten Verfahren ausgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung wird weiter im Detail beschrieben werden in Bezug auf Beispiele, Referenzbeispiele, und Versuchsbeispiele, bei welchen nicht beabsichtigt wird, die vorliegende Erfindung in irgend einer Art und Weise zu beschränken.
Beispiele
Referenzbeispiel 1:
Herstellung von dielektrophoretischem Elektroden-Substrat
Eine Multi-Elektroden-Anordnung, welche einen Mindestabstand von 7 μm, einen Elektrodenabstand von 20 μm, und eine Anzahl von 2016 (1008 Paaren) von Elektroden aufweist, wurde gestaltet und eine Fotomaske wurde gemäß dem Design hergestellt, um die Elektroden wie folgt herzustellen.
Auf einem Glas-Substrat, auf welchem Aluminium aufgebracht wurde und auf welchem ein Fotolack angebracht wurde, wurde ein Elektroden-Bild (wie hergestellt) auf einer Elektronenstrahl-Zeichenmaschine gezeichnet, und dann wurde der Fotolack entwickelt und das Aluminium wurde geäzt, um die Fotomaske herzustellen.
Das Elektroden-Substrat wurde gemäß dem Verfahren wie in T. Hashimoto, „Illustrative Photofabrication", Sogo-denshi Veröffentlichung (1985) hergestellt, wie im Folgenden beschrieben.
Die Fotomaske, die dadurch hergestellt wurde, war fest in Berührung mit dem aluminiumbesetzten Glas-Substrat, an welchem ein Fotolack angebracht wurde, und wurde dann mit einer Quecksilberlampe dem Elektrodenbild ausgesetzt. Das Elektroden-Substrat wurde durch Entwicklung des exponierten Glas-Substrats für die Elektrode und durch Ätzen der Aluminium-Fläche, gefolgt von der Entfernung des Fotolacks, welcher auf der Aluminium-Fläche zurück geblieben ist, hergestellt. Die Aluminium-Oberfläche, welche elektrochemische Aktivitäten aufwies, war durch Spin-Coating eines verdünnten Fotolacks mit einer organischen dünnen Beschichtung mit einer Dicke von 5 nm ausgestattet.
4 und 5 zeigen entsprechend die schematischen Ansichten des hergestellten Elektroden-Substrats und die Elektrode. In 4 bezeichnet 1 die Elektrode.
Referenzbeispiel 2:
Herstellung eines Elektroden-Substrats, welches eine Flussbahn aufweist.
Um Moleküle durch die Bewegung der Moleküle unter einem ungleichförmigen Gleichstromfeld zu trennen, wurde unter Verwendung von Silikon-Kautschuk eine Flußbahn auf dem Elektroden-Substrat im Referenzbeispiel 1 hergestellt.
Die Silikon-Kautschuk-Flußbahn zur Sendung einer moleküllösenden Lösung auf der Elektrode wies eine Tiefe von 25 μm und eine Breite von 400 μm auf und war so konstruiert, dass die Flussbahn durch eine Region verläuft, in welcher die Elektrode auf dem Elektroden-Substrat platziert war.
Ihre Herstellung wurde gemäß dem in T. Hashimoto, „Illustrative Photofabrication", Sogo-denshi Veröffentlichung (1985) beschriebenen Verfahren ausgeführt. Zuerst wurde ein blattartiger negativer Fotolack, welcher eine Stärke von 25 μm aufwies, auf das Glas-Substrat aufgebracht, exponiert mit einer Fotomaske, welche konstruiert wurde, um die Flussbahn herzustellen, und der negative Fotolack wurde entwickelt. Ungehärteter Silikonkautschuk wurde unter Verwendung des negativen Fotolack-Substrats als ein Templat gegossen, und wurde dann ausgehärtet, um eine Silikonkautschuk-Fläche zu produzieren, welche eine konkave Fläche mit einer Größe von 25 μm in der Region aufweist, in welcher die Elektrode platziert wurde.
Das Elektroden-Substrat und die Silikonkautschuk-Flussbahn wurden mit einem aushärtenden Zweiflüssigphasen (engl.: "two-fluid-type") – Silikonkautschuk in solcher Art und Weise verbunden, dass die konkave Fläche des Silikonkautschuks der Region zugewandt war, auf welcher die Elektrode auf dem Elektroden-Substrat platziert war. Eine Spritze zur Injektion einer Lösung wurde stromaufwärts auf der Flussbahn platziert, und eine Vorrichtung, welche einer Lösung, in welcher die Moleküle gelöst wurden, gewährt, auf der Elektrode zu fließen, wurde dem Elektroden-Substrat beigegeben.
6 und 7 zeigen die schematischen Ansichten des Elektroden-Substrats, welches die ausgebildete Flussbahn und den Abschnitt entlang der Linie a-a' entsprechend zeigt. In 6 zeigt 1 die Elektrode, und der Pfeil zeigt die Bewegungsrichtung der Lösung an, in welcher zwei oder mehrere Arten von Molekülen gelöst sind.
Beispiel 1:
Detektion von Biotin-Molekülen mit einem dielektrophoretischen Chromographie-Apparat (Feld-Fluss-Fraktions-Apparat)
Biotin wurde an die λ-DNA als trennungsverbessernde Substanz bei der Dielektrophorese gebunden, um biotinylierte λ-DNA zu ergeben, welche dann mit einem fluoreszin-markierten Antibiotin – Antikörper gemischt wurde, um die Antigen-Antikörper-Reaktion auszuführen unter der Verwendung des Resultats als Probe; quantitative Detektion wurde mit einem dielektrophoretischen Chromatographie-Apparat ausgeführt.
(Reagenzien)
Die biotinylierte λ-DNA, in welcher Biotin mit λ-DNA verbunden wurde, wurde unter Verwendung eines Photo-Biotin-Labeling-Kits (Nippon Gene Co. Ltd.) gemäß dem beigefügten Fertigungsprotokoll hergestellt. Die Komponenten wurden dann nach in Tabelle 1 gezeigten Verhältnissen in 50 nM PBS (p-H 7,5) gemischt, um die Antigen-Antikörper-Reaktion auszuführen. Die Konzentration von gesamter λ-DNA in jeder Probe wurde durch Zugabe von nicht-biotinylierter λ-DNA auf 0,32 nM abgestimmt, was der Konzentration von biotinylierter λ-DNA in der Probe, welche eine Biotinkonzentration von 128 nM (Probe Nr. 5) aufweist, entspricht.
Tabelle 1
Nachdem die Antigen-Antikörper-Reaktion abgeschlossen war, wurde das Reaktionsmedium durch 2,5 mM Carbonatpuffer (pH 10) unter Verwendung eines Ultrafiltrations-Filters, welcher ein Abschnitts-Molekulargewicht (engl.: „cut off molecular weight") von 50000 aufwies, ersetzt, um Proben zu erzeugen.
(Vorgänge)
Die oben beschriebenen Reaktionslösungen wurden zu dem Elektroden-Substrat gespeist, welches eine im Referenzbeispiel 2 ausgestaltete Flussbahn aufweist, mit einer Flussrate von 800 μm/sec an der Probeninjektionsmündung unter Verwendung einer Mikrospritzpumpe (KSD 100, Aishisu Co., Inc.). Das angelegte elektrische Feld wies eine Frequenz von 1 MHz und eine elektrische Feldstärke von 0,9 MV/m auf (definiert als die zum Einsatz kommende Spannung/7 μm des Engstspaltes).
Die oben erwähnten Molekül-Proben wurden in die Probereinjektions-Mündung auf dem Elektroden-Substrat eingebracht, und das Fluoreszenz-Ergebnis wurde nahe dem Auslass der Flussbahn unter Anwendung des vorher festgelegten elektrischen Feldes für eine Dauer von 30 bis 80 Sekunden nach Einbringung jeder Probe gemessen.
Messungen wurden ausgeführt durch Aufnehmen von fluoreszierenden Bildern, alle ungefähr 5 Sekunden an einem Flußbahnbereich nahe dem Auslaß der Flußbahn unter einem konfokalen Lasermikroskop (LSM-GB 200, Olympus Optical Co., Ltd.) und Berechnung der Summe von Helligkeitswerten all der Pixel (nachstehend als die Fluoreszenzmenge bezeichnet). Bei den Messungen, bei denen die perfekten konfokalen Bilder verwendet wurden, sind für den Fall, dass die Distribution der Fluoreszenzintensität mit der Tiefe der Flussbahn stattfindet, keine akkuraten Ergebnisse zu erreichen. Das heißt, dass die Öffnung an dem Photomultiplizierer des Lasermikroskops vollständig geöffnet wurde, um auch zu ermöglichen die Fluoreszenz abhängig von der Tiefe zu integrieren und zu messen.
Die Fangrate kann aus der folgenden Gleichung 1 errechnet werden.
Bei diesen Messungen, bei denen das elektrische Feld nicht zum Einsatz kommt, ist die Fluoreszenzmenge an dem Elektrodenauslaß entsprechend der am Einlaß, weil Proben, welche fluoreszenz-markierte Moleküle aufweisen, sich mittels der Spritzpumpe auf der Elektrodenstruktur bewegen. Allerdings wird die Fluoreszenzmenge gemindert, wenn das elektrische Feld angelegt wird und Moleküle durch dielektrophoretische Kräfte zur Elektrode gezogen werden. Deshalb wird die verringerte Menge der Fluoreszenzmenge als Fangmenge der Moleküle genommen und verwendet, um die Menge der Moleküle, welche zur Elektrode gezogen werden, anzuzeigen, wenn die totale Menge der initialen Moleküle 100 ist. Fangmenge (%) = (F_ – F+) × 100/F_ (1)worin,

F_:: die Fluoreszenzmenge ohne Einsatz des elektrischen Feldes
F₊:: die Fluoreszenzmenge während des Einsatzes des elektrischen Feldes

(Ergebnisse)
Die Ergebnisse werden in 8 gezeigt. Bei Einsatz von 0,9 MV/m der elektrischen Feldstärke bei diesen Experimenten, war die Fangmenge etwa 100% für die λ-DNA und 0% für den fluorescein-markierten, antibiotinen Antikörper. Bei einer Biotinkonzentration von 0 pM wurde der markierte Antikörper nicht auf der Elektrode eingefangen, da es keine biotinylierte λ-DNA gab, die durch den fluorescein-markierten antibiotinen Antikörper erkannt wurde, und die Fangrate zeigte fast 0%. Es wird erwartet, dass der markierte Antikörper, der einen Komplex mit der auf der Elektrode gefangenen biotinylierten λ-DNA bildet, auch auf der Elektrode gefangen wird, wenn die biotinylierte λ-DNA hinzufügt wird, da der fluorescein-markierte antibiotine Antikörper durch die Antigen-Antikörper-Reaktion an Biotin gebunden wird. Deshalb dient die in diesem Fall angezeigte Fangrate zum Repräsentieren der Rate der Antikörper, gebunden an die biotinylierten λ-DNA, unter den gesamten antibiotinen Antikörpern, welche in der Probe enthalten sind. Bei Biotinkonzentrationen von 0 bis 3,2 nM wurde die Fangrate proportional gesteigert, um die Biotinkonzentration zu steigern, und es kann daher gesagt werden, dass das Antigen quantitativ detektiert wird. Im Gegensatz dazu würden für Proben, die eine Biotinkonzentration von 3,2 mM oder höher aufweisen, kleine Steigerungen der Fangrate gefunden, und die Einfangsrate lag im Bereich von fast 30%. Als eine Ursache ist es wahrscheinlich, dass der bei diesem Beispiel verwendete fluorescein-markierte antibiotine Antikörper einen niedrigen Antikörper-Titer aufwies und der Antikörper, der fähig ist, Biotin zu binden, im Bereich von nur 30% der gesamten Antikörper present war.
Bis jetzt ist es unmöglich, einen Biotin-Komplex und einen fluoreszin-markierten antibiotinen Antikörper von einem nichtreagierten fluoreszin-markierten anti-biotinen Antikörper durch dielektrophoretische Chromatographie zu trennen und die Detektion eines Komplexes mit Biotin wurde nicht erreicht, weil es bei der dielektrophoretischen Trennung zwischen dem Komplex und dem unreagierten Antikörper keinen ausreichenden Unterschied gibt. Die oben erwähnten Ergebnisse zeigen auf, dass die Anwendungen einer trennungsverbessernder Substanz ermöglichen können, Moleküle, die bisher nicht detektiert wurden, durch dielektrophoretische Chromatographie quantitativ zu detektieren.
Beispiel 2:
Detektion von α-Fetoprotein (AFP) mit antikörper-immobilisierenden Latexkügelchen als trennungsverbessernde Substanz
Alpha-Fetoprotein (AFP) reagierte mit Latexkügelchen, auf welchen ein Anti-α-fetoprotein (AFP)-Antikörper A4-4 immobilisiert wurde, und durch weitere Reaktion mit einem fluorescein-markierten Anti-AFP-Antikörper WA1 Fab' wurde ein Komplex gebildet, welcher ein anderes Epitop als das von A4-4 aufweist. AFP wurde durch Trennung des Komplexes von dem unkomplexierten, fluorescein-markierten Anti-AFP-Antikörper WA1 auf der Elektrode detektiert.
2-1 Detektion von AFP im Puffer
(Reagenzien)
Vorbereitung der Latexkügelchen, welche den Anti-AFP-Antikörper immobilisieren:
1,2 mg eines durch die Erfinder erstellten Anti-AFP-Antikörpers A4-4 und 10 mg Latexkügelchen mit einem Durchmesser von 120 nm (Reagenz Latex N-100, Sekisui Chemical Ca., Inc.) wurden in einer Citratlösung gemischt (pH 3) und dann wurden die Kügelchen durch Zentrifugieren als Präzipitat gesammelt. Die gesammelten Kügelchen wurden in 2,5% BSA-Lösung suspendiert, um die Oberfläche der Kügelchen zu blockieren, was Latexkügelchen hervorbrachte, auf welchen der Anti-AFP-Antikörper A4-4 absorbiert war. Die gebildeten Latexkügelchen hatten 123 μg Anti-AFP-Antikörper A4-4 pro 1 mg Latexkügelchen absorbiert.
Vorbereitung von fluorescein-markiertem Anti-AFP-Antikörper WA1 Fab':
40 mg eines Anti-AFP-Antikörpers WA1 wurden mit Pepsin biologisch abgebaut, und dann mit 2-Aminoethanthiol (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) reduziert, um 15 mg Fab' zu erhalten. 15 mg des Anti-AFP-Antikörpers WA1 Fab' und 150 μg Fluorescein-Isothiocyanat (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) wurden in 10 ml Carbonatpufferlösung (pH 9) gemischt, und ein fluorescein-markierter Anti-AFP- Antikörper WA1 Fab' wurde unter Verwendung einer NAP-25-Säule (Amersham pharmacia biotech) hergestellt.
Reaktion:
Die Antigen-Antikörper-Reaktion wurde durch Mischungen der Komponenten, wie in Tabelle 2 gezeigt, in 50 mM PBS (pH 7,5) und zweistündigem Stehen bei Raumtemperatur durchgeführt.
Tabelle 2
Nachdem die Antigen-Antikörper Reaktion abgeschlossen war, wurden die Reaktionslösungen 100-fach mit destilliertem Wasser verdünnt, und die Resultate wurden dielektrophoretischer Trennung unterworfen.
(Vorgänge)
Auf die im Referenzbeispiel 1 beschriebene dielektrophoretische Elektrode wurden 20 μl der oben erwähnten Lösungen getropft, und ein Deckglas, bei dem jede Seite 22 mm misst, wurde platziert. Fluoreszierende Bilder wurden vor und während dem Anlegen des elektrischen Feldes unter Verwendung eines konfokalen Lasermikroskops gemacht. Das angewandte elektrische Feld hatte eine Frequenz von 100 kHz und eine elektrische Feldstärke von 1,4 MV/m.
Analyse der fluoreszierenden Bilder wurde unter Verwendung einer Bildanalysesoftware Scion Image ausgeführt. Nachdem die Farbtongradation der fluoreszierenden Bilder vor und während der Anwendung des elektrischen Feldes durchschnittlich war, wurde die Gradation des Farbtones der Bilder vor Anwendung des elektrischen Feldes von der während der Anwendung des elektrischen Feldes subtrahiert, so dass nur Bereiche, welche durch Anwendung des elektrischen Feldes erhöhte Fluoreszenz aufwiesen, angezeigt wurden. Das Densitogramm der Bereiche, welche eine Erhöhung der Fluoreszenz aufwiesen, wurde gewonnen, um das gesteigerte Maß an Fluoreszenz als Bildausgangskonzentrationswerte auszudrücken.
(Resultate)
Aufgrund des Empfangs negativer dielektrophoretischer Kräfte bewegten sich die Kügelchen als Resultat der Dielektrophorese auf der Elektrode zu einer schwachen Region in der elektrischen Feldstärke, und die anderen biologischen Moleküle, welche den unreagierten fluorescein-markierten Anti-AFP Antikörper WA1 Fab' beinhalteten, bewegten sich aufgrund des Empfangs positiver dielektrophoretischer Kräfte zu einer starken Region in der elektrischen Feldstärke und erlaubten dadurch eine Trennung der Anti-AFP-Antikörper-immobilisierten Latex-Kügelchen/AFP/fluoresceinmarkierten Anti-AFP-Antikörpers WA1 Fab'-Komplexes von dem unreagierten fluorescein-markierten Anti-AFP-Antikörper WA1 Fab' auf der Elektrode.
9 zeigt Fluoreszenzbilder die von einem Lasermikroskop vor und während der Anwendung des elektrischen Feldes auf der Elektrode gemacht wurden, als AFP bei 0,35 μM hinzugefügt wurde. Bei den Proben, welche AFP enthalten, wurde Fluoreszenz aufgrund der negativen dielektrophoretischen Kräfte vor und während des Einsatzes des elektrischen Feldes auf der Aluminiumelektrode erhöht, während bei der Probe, die kein AFP enthält, vor und während des Einsatzes des elektrischen Feldes keine Veränderung der Bilder festgestellt werden konnte. Diese Bilder wurden mit Scion Image bearbeitet, um Densitogramme der Bandregionen zu erhalten, wobei die Fluoreszenz gesteigert wurde und die gesteigerte Fluoreszenz als Bildoutput-Konzentrationswerte ausgedrückt wurde. 10 zeigt das Verhältnis zwischen AFP-Konzentrationen und der erhöhten Menge an Fluoreszenz.
Durch die Resultate aus 10 ist es selbstverständlich, dass eine gute Dosis-Wirkung zwischen den hinzugefügten AFP-Konzentrationen und den Bildausgangskonzentrationswerten gefunden werden kann und dass AFP quantitativ detektiert werden kann.
2-2 Detektion von AFP im Serum
(Reagenzien)
Es wurden die gleichen Reagenzien wie in 2-1 verwendet.
Reaktion:
Nachdem Proben, welche die Komponenten wie in Tabelle 2 aufweisen mit normalem Serum, welches kein AFP enthält, hergestellt wurden, wurde die Antigen-Antikörper Reaktion durch zweistündiges Stehen bei Raumtemperatur ausgeführt.
Nachdem die Antigen-Antikörper Reaktion abgeschlossen war, wurden die Reaktionslösungen 100-fach mit destilliertem Wasser verdünnt und die Resultate wurden Dielektrophorese unterworfen.
(Vorgänge)
Die Prozeduren wurden ähnlich denen in 2-1 ausgeführt.
(Resultate)
Die Resultate sind in 11 gezeigt. Wie aus 11 hervorgeht, wird eine gute Quantitativität innerhalb des Bereichs, in welchem AFP vorhanden ist, erhalten. Durch diesen Befund ist es selbstverständlich, dass, wenn Serum als Proben verwendet wird, Komponenten im Serum Dielektrophorese nicht stark beeinflussen, und die Detektion eines im Serum zu messenden Proteins kann erreicht werden.
Aufgrund dieser Resultate erlaubt die Verwendung von einer Substanz, welche negative Dielektrophorese aufweist, wie Latex-Kügelchen, als trennungsverbessernde Substanz eine Trennung einer biologischen Komponente auf der Dielektrophorese-Elektrode, welche positive Dielektrophorese aufweist, und wird es ermöglichen, ein Protein auf molekularer Ebene quantitativ zu trennen und zu detektieren, was bisher unmöglich war.
Beispiel 3:
Detektion von λ-DNA mit an DNA-Proben gebundene Latexkügelchen als trennungsverbessernde Substanz
(Reagenzien)
Vorbereitung von 2 kb Test-DNA immobilisierter Latex-Kügelchen:
Um Streptavidin-Kügelchen zur Fixierung einer Test-DNA herzustellen, wurde auf carboxylierten Latexkügelchen mit einem Durchmesser von 2 μm (Polysciences, Inc.) unter Verwendung eines Carbodiimide Kits für carboxylierte Mikropartikel (Polysciences, Inc.) Streptavidin immobilisiert. Als Test-DNA wurde ein Produkt verwendet, welches durch Verstärkung von 2 kb einer ca. mittleren Sequenz von λ-DNA durch PCR unter Verwendung eines 5'-biotin-markierten 5'-CTATGACTGTACGCCACTGTCC-3'-Primers und eines 5'-CAATCACCAACCCAGAAAACAATG-3'-Primers erhalten wurde. Das Produkt reagierte mit den streptavidin-immobilisierten Kügelchen, um 2 kb DNA-immobilisierte Latex-Kügelchen herzustellen.
Die 2 kb-DNA immobilisierten vorbereiteten Latex-Kügelchen würden für 5 Minuten in 0,3 N NaOH gehalten, um die 2 kb-DNA zu Einzelsträngen zu denaturieren. Nachdem die Kügelchen durch Zentrifugieren präzipitiert wurden, wurden die Kügelchen in 0,3 N NaOH resuspendiert. HCl-Lösung wurde zu der Endkonzentration von 0,3 N zur Neutralisation hinzugefügt, um 2 kb Test-DNA-immobilisierter Latex-Kügelchen herzustellen.
Markieren und Denaturieren zu Einzelsträngen von λ-DNA und T7 DNA:
Lambda-DNA und T7 DNA, welche eine unterschiedliche Sequenz als λ-DNA aufweisen, wurden mit Fluorescein (grüne Fluoreszenz) bzw. Cy 3 (rote Fluoreszenz, Molecular Probes, Inc.) unter Verwendung von „Label IT Nucleic Acid Labeling Kit" markiert. Die markierten DNAs wurden zu Einzelsträngen denaturiert, indem sie für 5 Minuten in 0,3 N NaOH bei Zimmertemperatur stehengelassen wurden, und dann durch Hinzufügen einer HCl-Lösung bis zur Endkonzentration von 0,3 N neutralisiert.
Hybridisierungs-Reaktion:
Im SCC-Puffer wurden 0,05% (w/v) der 2 kb λ-DNA immobilisierten Latex-Kügelchen zu der markierten einzelsträngigen λ-DNA und T7-DNA bis zur Endkonzentration von 20 μg/ml hinzugefügt und die Hybridisierung wurde bei 68°C durchgeführt. Die Probenlösung nach der Hybridisierungsreaktion wurde 100-fach mit destilliertem Wasser verdünnt und wurde Dielektrophorese unterworfen.
(Prozeduren)
Die Prozeduren wurden ähnlich denen in 2-1 ausgeführt, wobei erwartet wurde, dass ein elektrisches Feld, welches eine Frequenz von 3 MHz und eine elektrische Feldstärke von 0,9 MV/m aufweist, zum Einsatz kommt.
(Resultate)
Die Resultate sind in 12 gezeigt.
Als die Lösung nach der Hybridisierung unter einem Fluoreszenz-Mikroskop beobachtet wurde, wurde nur die Fluoreszenz von Cy3, mit welcher die λ-DNA markiert wurde, auf den Kügelchen beobachtet. Als das elektrische Feld, nachdem diese Lösung auf die dielektrophoretische Elektrode getropft wurde, angelegt wurde, empfingen die Latex-Kügelchen negative dielektrophoretische Kräfte und bewegten sich zu einer schwachen Region in der elektrischen Feldstärke, so dass die Fluoreszenz der Cy3-markierten λ-DNA, welche an die 2 kb DNA-Probe gebundenen Kügelchen gebunden ist, in einer schwachen Region in der schwachen elektrischen Feldstärke beobachtet wurde. Im Gegensatz dazu wurde die Fluoreszenz von fluorescein-markierter T7-DNA, welche nicht an die 2 kb-DNA-immobilisierten Kügelchen gebunden ist, aufgrund einer Bewegung zu der starken Region in der elektrischen Feldstärke durch positive dielektrophoretische Kräfte an der Grenzregion der Elektrode beobachtet. Dieses Beispiel demonstriert demnach, dass die Verwendung von Latex- Kügelchen als dielektrophoretische, trennungsverbessernde Substanz es ermöglicht, spezifische DNA-Moleküle unter vielerlei Molekülarten zu separieren und zu detektieren.
Aufgrund dieser Resultate ist es selbstverständlich, dass eine dielektrophoretische, trennungsverbessernde Substanz bei dielektrophoretischer Trennung für die Detektion einer Substanz nützlich ist.
Experimentelles Beispiel 1:
Beobachtung der Moleküle auf der Elektrode
(1) Beobachtung von DNA-Molekülen
Als DNA-Proben wurden 1 ml reinster Wasserlösung, welche 0,001 mg λ-DNA (48,5 kb, doppelsträngig) enthält verwendet, welche mit einem fluoreszierenden Reagenz YO-PRO-1 (ein Markenname von Molecular Probes, Inc.) gemäß dem Verfahren, welches in R. P. Hogland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, sechste Ausgabe, Molecular Probes, Inc. (1996) beschrieben wird, bzw. 1 ml reinster Wasserlösung, welche 0,002 mg von einem Oligonukleotid (22 Basen, einzelsträngige DNA, bereitgestellt durch die Erfinder), welches am Ende mit einem fluoreszierenden Fluorescein-Farbstoff markiert wurde, als es durch ein gewöhnliches Verfahren als kurze DNA synthetisiert wurde.
Um zu kontrollieren, ob DNA-Moleküle auf dem im Referenzbeispiel 1 hergestellten Elektrodensubstrat Dielektrophorese ausgesetzt sind oder nicht, wurden 10 μl der entsprechenden oben beschriebenen DNA-Proben (die markierte λ-DNA und Oligonukleotid) auf das Elektrodensubstrat getropft, und die Fluoreszenz der DNA-Proben wurde unter einem Fluoreszenz-Mikroskop durch graduelles Hinzufügen einer Wechselspannung mit einer Frequenz von 1 MHz zur Elektrode beobachtet.
Es wurde beobachtet, dass die λ-DNA anfing, sich durch Dielektrophorese von etwa 500 kV/m der elektrischen Feldstärke an einer starken elektrischen Feldposition am Engstspalt zwischen den Elektroden zu sammeln. Bei dieser elektrischen Feldstärke wurde es jedoch nicht beobachtet, dass die Oligonukleotide sich durch Dielektrophorese an einer starken elektrischen Feldposition sammelten.
(2) Beobachtung von Proteinmolekülen
Als Proteinproben wurden eine ultrareine Wasserlösung, welche 0,1 mg IgM (Molekulargewicht etwa 900 kDa), welche mit einem fluoreszierenden Reagenz FITC (Fluorescein Isothiocyanat, Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) gemäß dem in H. Maeda, Journal of Biochemistry, 65, 777 (1969) beschriebenen Verfahren markiert wurde, bzw. eine ultrareine Wasserlösung, welche 0,1 mg BSA (Molekulargewicht etwa 65 kDa), welches mit einem fluoreszierenden Reagenz TRITC (Tetramethylrhodamin Isothiocyanate, Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) gemäß dem in H. Maeda, Journal of Biochemistry, 65, 777 (1969) beschriebenen Verfahren markiert wurde, verwendet.
Um zu kontrollieren, ob Proteinmoleküle auf dem Elektrodensubstrat Dielektrophorese ausgesetzt sind oder nicht, wurden 10 μl der entsprechenden oben beschriebenen Proteinproben (das markierte IgM und BSA) auf das Elektrodensubstrat getropft, und die Fluoreszenz der DNA-Proben wurde unter einem Fluoreszenz-Mikroskop durch graduelles Hinzufügen einer Wechselspannung mit einer Frequenz von 1 MHz zur Elektrode beobachtet.
Es wurde beobachtet, dass das FITC-markierte IgM anfing, sich an einer starken elektrischen Feldposition von etwa 1,0 MV/m der elektrischen Feldstärke am Engstspalt der Elektrode zu sammeln. Bei dieser elektrischen Feldstärke wurde es jedoch kaum beobachtet, dass das TRITC-markierte BSA sich durch Dielektrophorese an einer starken elektrischen Feldposition sammelte.
Experimentelles Beispiel 2:
Analyse von Molekülen mit dem Elektroden-Substrat, welches eine Flussbahn aufweist
(Reagenzien)
Als Molekül-Proben wurden die markierten λ-DNA und die Oligonukleotid-Lösungen, welche im experimentellen Beispiel 1 verwendet werden, verwendet.
(Vorgänge)
Die oben beschriebenen Molekül-Lösungen wurden zum Elektroden-Substrat, welches die Flußbahn, welche im Referenzbeispiel 2 hergestellt wurde, aufweist, mit einer Flussrate von 800 í m/sec an dem Probeninjektionsport unter Verwendung einer Mikrospritzpumpe (KSD 100, Aishisu Co., Inc.) gespeist. Das eingesetzte elektrische Feld wies eine Frequenz von 1 MHz und elektrische Feldstärken von wenigen hundert kV/m bis zu wenigen MV/m auf (bezeichnet als die zum Einsatz kommende Spannung/7 μm der Engstspalte).
Jede Molekülprobe (10 μg/ml der markierten λ-DNA oder 0,56 pg/ml der markierten Oligonukleotide) wurde an dem Probeninjektionsport auf dem Elektrodensubstrat eingeführt, und die Menge der Fluoreszenz wurde nahe dem Flussbahnauslass unter Einsatz des vorher festgelegten elektrischen Feldes für eine Dauer von 30 bis 80 Sekunden nach Einführung jeder Probe gemessen.
Messungen wurden durch Aufnahme fluoreszenter Bilder etwa alle 5 Sekunden an der Flussbahn nahe dem Auslass der Flussbahn unter Verwendung eines konfokalen Lasermikroskops (LSM-GB 200, Olympus Optical Co., Ltd.) und Berechnung der Summe der Helligkeitswerte aller Pixel (nachstehend bezogen auf die Fluoreszenz-Menge) ausgeführt. Bei den Messungen, bei denen perfekte konfokale Bilder verwendet wurden, für den Fall dass die Distribution der Fluoreszenzintenstität mit der Tiefe der Flussbahn stattfindet, konnten akkurate Resultate nicht beobachtet werden. Demzufolge wurde die Öffnung auf dem Photomultiplizierer auf dem Lasermikroskop vollständig geöffnet, um zu ermöglichen, die Fluoreszenz auch abhängig von der Tiefe zu integrieren und zu messen.
Die Einfangrate wurde durch die oben beschriebene Gleichung 1 berechnet.
Bei den Messungen, bei denen das elektrische Feld nicht zum Einsatz kommt, ist die Fluoreszenz-Menge, welche am Elektrodenauslass gemessen wurde, gleich mit der am Einlass, da Proben der fluoreszenz-markierten Moleküle sich mittels der Spritzpumpe auf der Elektrodenstruktur bewegen. Allerdings wird die Fluoreszenzmenge abnehmen, wenn das elektrische Feld zum Einsatz kommt und Moleküle durch dielektrophoretische Kräfte zu der Elektrode gezogen werden. Deshalb wird die verminderte Menge in der Fluoreszenzmenge als Fangmenge der Moleküle genommen und verwendet, um die Menge der Moleküle anzuzeigen, welche zur Elektrode gezogen werden, wenn von der Gesamtmenge der Initialmoleküle angenommen wird, dass sie 100 beträgt.
(Resultate)
13 zeigt den Zeitablauf der Fluoreszenzmenge am Auslass der Flussbahn, während die markierte λ-DNA-Lösung verwendet wurde und das zum Einsatz kommende elektrische Feld eine elektrische Feldstärke von 0,60 oder 1,04 MV/m aufwies. 14 zeigt den Zeitablauf der Fluoreszenzmenge am Auslass der Flussbahn, während die markierte Oligonukleotid-Lösung verwendet wurde und das zum Einsatz kommende elektrische Feld eine elektrische Feldstärke von 1,4 MV/m aufwies. In 13 werden Ergebnisse unter der eingesetzten elektrischen Feldstärke von 0,60 MV/m durch offene Kreise und Ergebnisse unter 1,04 MV/m durch geschlossene Kreise angezeigt.
Wie in 13 gezeigt, ist es offensichtlich, dass, wenn die markierte λ-DNA verwendet wurde und das zum Einsatz kommende elektrische Feld eine elektrische Feldstärke von 1,04 MV/m aufwies, die Fluoreszenzmenge an dem Auslass der Flussbahn auf nahe Null reduziert wurde, da das elektrische Feld stark genug war und all die λ-DNA an der Elektrode gefangen war. Ein dauerhafter Anstieg der Fluoreszenzmenge nach 80 Sekunden ist zurückzuführen auf die Beendigung des elektrischen Feldes, resultierend in der Freigabe der DNA-Moleküle, welche bis dahin an der Elektrode angesammelt waren, und dadurch vorübergehend eine größere Fluoreszenzmenge gebend als die des Anfangszustandes. Nachdem die gefangene DNA freigegeben wurde, wurde die Fluoreszenzmenge auf das Anfangslevel zurückgesetzt. Ein ähnliches Bild konnte ebenfalls erkannt werden, als die markierte λ-DNA-Lösung verwendet wurde und das zum Einsatz kommende elektrische Feld eine elektrische Feldstärke von 0,60 MV/m aufwies. Allerdings ist es selbstverständlich, dass die Fluoreszenzmenge während des Einsatzes des elektrischen Feldes (für einen Zeitraum von 30 bis 80 Sekunden) nicht auf Null reduziert wurde, mit anderen Worten, die DNA wurde nicht komplett gefangen, da die elektrische Feldstärke nicht ausreichend war. Obwohl die λ-DNA kräftig an einer starken elektrischen Feldposition bei einer elektrischen Feldstärke von 0,5 MV/m im experimentellen Beispiel 1 gehalten wurde, ist es bei diesen Experimenten darüber hinaus selbstverständlich, dass, wenn eine ähnliche Fähigkeit zur Aufbringung von DNA auf der Elektrode erhalten werden soll, es notwendig ist, eine stärkere elektrische Feldstärke als die ohne das Fließen in der Flußbahn bereitzustellen, weil der aus dem Fließen resultierende Widerstand hinzugefügt ist.
Wie in 14 gezeigt, ist es selbstverständlich, dass, wenn die markierte Oligonukleotid-Lösung verwendet wurde und das zum Einsatz kommende elektrische Feld eine elektrische Feldstärke von 1,4 MV/m aufwies, keine Minderung der Fluoreszenz-Menge beobachtet wurde, das heißt, dass das markierte Oligonukleotid überhaupt nicht an diese elektrische Feldstärke gebunden ist.
Diese Resultate zeigen, dass λ-DNA und ein Oligonukleotid durch Verwendung des Trennungsverfahrens der vorliegenden Erfindung voneinander getrennt werden können.
Beispiel 4:
Trennung von DNA-Molekülen in Lösungen
Die entsprechenden Bestandteile wurden von Lösungen getrennt, in welchen λ-DNA (48,5 kb, doppelsträngig) und ein Oligonukleotid (22 Basen, einzelsträngige DNA) enthalten waren.
(Proben)
Vorausgegangene Messungen der Fluoreszenzintensität wurden ausgeführt, um zu bekräftigen, dass 5 μg/ml von λ-DNA (48,5 kb, doppelsträngig), markiert mit einem fluoreszierenden Reagenz YO-PRO-1, und 2,3 pg/ml von einem Oligonukleotid (22 Basen, einzelsträngige DNA), markiert mit dem fluoreszierenden Reagenz Fluorescein am Ende in der Synthese als eine kurzkettige DNA, die gleiche Menge an Fluoreszenz emittieren. Als Proben wurden ultrareine Wasserlösungen verwendet, welche die markierten Oligonukleotide und die markierte λ-DNA in vorgegebenen Konzentrationen, wie in der folgenden Tabelle 3 gezeigt, basierend auf diesen Ergebnissen enthalten.
Tabelle 3
(Vorgänge)
Die Proben wurden zu dem Elektroden-Substrat gespeist, welches die im Referenz-Beispiel 2 hergestellte Flussbahn aufweist, mit einer Flußrate von 800 μm/sec an der Probeninjektionsöffnung unter Verwendung einer Mikrospritzpumpe (KSD 100, Aishisu Co., Inc.). Das zum Einsatz kommende elektrische Feld wies eine Frequenz von 1 MHz und eine elektrische Feldstärke von 0,86 MV/m oder 1,02 MV/m auf, und das vorher bestimmte elektrische Feld wurde für eine Zeitspanne von 30 bis 80 Sekunden angelegt, nachdem die Probe injiziert wurde, um die Fluoreszenzmenge der markierten λ-DNA nahe des Auslasses der Flußbahn zu messen. Die Messungen und die Bestimmung der Fangrate wurden wie im experimentellen Beispiel 2 ausgeführt.
(Resultate)
Die Resultate werden in 15 gezeigt, in welcher die Ergebnisse der Probe, welche ein Mischverhältnis von 0 : 1 von den markierten Oglionukleotiden und λ-DNA aufweist, durch offene Kreise, die Ergebnisse der Probe, welche ein Mischverhältnis von 1 : 1 aufweist, durch offene Vierecke, die Ergebnisse der Probe, welche ein Mischverhältnis von 5 : 1 aufweist, durch + und die Ergebnisse der Probe, welche ein Mischverhfältnis von 1 : 0 aufweist, durch x angezeigt werden.
Bei diesem Beispiel ist die Einfangrate unter Berücksichtigung des Ereignisses, bei dem all die λ-DNA gefangen ist und die Oligonukleotide überhaupt nicht gefangen sind, äquivalent dem Prozentsatz der Fluoreszenzmenge, welche von der λ-DNA abgeleitet wurde, welche in der Fluoreszenzmenge der gesamten Probe beansprucht wird. Das heißt, dass Probe 1 (eine Probe, welche ein Mischverhältnis von 0 : 1 von den markierten Oligonikleotiden und λ-DNA aufweist) eine Einfangrate von 100% bieten sollte, Probe 2 (eine Probe, welche ein Mischverhältnis von 1 : 1 von den markierten Oligonukleotiden und λ-DNA aufweist) eine Einfangrate von 1/(1 + 1) = 50% bieten sollte, Probe 3 (eine Probe, welche ein Mischverhältnis von 5 : 1 von den markierten Oligonukleotiden und λ-DNA aufweist) eine Einfangrate von 1/(1 + 5) = 16,7% bieten sollte, und Probe 4 (eine Probe, welche ein Mischverhältnis von 1 : 0 von dem markierten Oligonukleotiden und λ-DNA aufweist) eine Einfangrate von 0% bieten sollte.
Aufgrund dieser Ergebnisse ist es selbstverständlich, dass, wenn das zum Einsatz kommende elektrische Feld eine elektrische Feldstärke von 0,86 MV/m aufwies, die Einfangrate der λ-DNA (Probe 1) 53% betrug und das Oligonukleotid (Probe 4) überhaupt nicht gefangen wurde. Zudem betrug die erhaltene Einfangrate für Probe 2 (eine Probe, bei der λ-DNA zu Oligonukleotiden = 1 : 1) halb so viel wie der oben genannte Wert, etwas mehr als 20%, und für Probe 3 (eine Probe, bei der λ-DNA zu Oligonukleotiden = 1 : 5) betrug die erhaltene Einfangrate ein bißchen weniger als 10%. Es ist selbstverständlich, dass diese Einfangrate beinahe konsistent sind zu den theoretischen Werten, welche von 53% der Einfangrate von Probe 1 berechnet wurden (Sample 2, 53% ÷ 1/(1 + 1) = 26,5%; Probe 3, 53% ÷ 1/(1 + 5) = 8,8%).
Wenn das zum Einsatz kommende elektrische Feld eine elektrische Feldstärke von 1,02 MV/m aufweist, ist es selbstverständlich, dass 100% der Einfangrate alleine für die λ-DNA (Probe 1) erhalten wurden und für die Oligonukleotide allein (Probe 4) kein Einfang erhalten wurde. Es ist ebenfalls selbstverständlich, dass Probe 2 eine Einfangrate von 60% ermöglichte und Probe 3 eine Einfangrate von etwa 20% er möglichte, und diese Einfangraten beinahe konsistent sind zu den entsprechenden theoretischen Werten 50% und 16,7%. Aufgrund dessen ist es selbstverständlich, dass λ-DNA und ein Oligonukleotid gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung in einer kurzen Zeit von ein paar zehn Sekunden voneinander getrennt werden können.
Aufgrund dieser Resultate ist es selbstverständlich, dass zwei oder mehrere Arten von Molekülen durch Selektion einer entsprechenden Stärke des elektrischen Feldes mit Kombinationen von einem zu trennenden Molekül und koexistierenden Molekül(en) voneinander getrennt werden können.
Beispiel 5:
Trennung von Proteinmolekülen in Lösungen
Die entsprechenden Komponenten wurden von Lösungen getrennt, in welchen IgM (Molekulargewicht, etwa 900 kDa) und BSA (Molekulargewicht, etwa 65 kDa) enthalten sind.
(Proben)
Als Proben wurden superreine Wasserlösungen, welche 0,1 mg/ml von IgM (Molekulargewicht, etwa 900 kDa), welches mit einem fluoreszierenden Reagenz FITC markiert ist, und 0,1 mg/ml von BSA (Molekulargewicht, etwa 65 kDa), welches mit einem fluoreszierenden Reagenz TRITC markiert ist, enthalten, verwendet.
(Vorgänge)
Die Prozeduren wurden gleich denen in Beispiel 1 ausgeführt, abgesehen vom Einsetzen einer Flußrate von 400 μm/sec und einer zum Einsatz kommenden elektrischen Feldstärke von 1,42, 1,78 oder 2,14 MV/m, und die Fluoreszenzmengen der markierten IgM und BSA wurden simultan gemessen, um die entsprechenden Einfangraten zu bestimmen.
(Resultate)
Die Resultate sind in 16 gezeigt, in welcher die Einfangraten der markierten IgM und BSA durch offene Kreise bzw. geschlossene Kreise dargestellt sind.
Aufgrund der in 16 gezeigten Resultate ist es selbstverständlich, dass sowohl für IgM als auch BSA die Einfangrate durch Erhöhung der elektrischen Feldstärken gesteigert wurde, und bei einer elektrischen Feldstärke von 2,14 MV/m die Einfangrate für IgM bei 68,5% und für BSA bei 38% lag und folglich ein klarer Unterschied der Einfangrate bezüglich des Unterschiedes des Molekulargewichts besteht.
Obwohl die Proteinmoleküle nicht fähig waren, komplett bei der in diesem Beispiel eingesetzten elektrischen Feldstärke gefangen zu werden, ist es leicht zu erwarten, dass die Trennung von IgM von BSA durch weiteres Ausdehnen der Trennungsregion auf der Elektrode erreicht werden kann, da ein signifikanter Unterschied in der Einfangrate gemäß dem Unterschied im Molekulargewicht gefunden wird. Das zeigt, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch eine Trennung gemäß dem Unterschied in der Größe auf molekularer Ebene der Proteine erlaubt.
Beispiel 6:
B/F-Trennung nach Antigen-Antikörper-Reaktion
Biotinmarkierte λ-DNA/fluorescin-markierte Antibiotin-Antikörper-Komplex-Moleküle und freie fluorescinmarkierte Antibiotin-Antikörper, welche nicht an biotinmarkierte λ-DNA gebunden sind, wurden aus Lösungen voneinander getrennt, welche durch Mischung von biotin-markierter λ-DNA und fluorescin-markiertem Antibiotin-Antikörper erhalten wurden, gefolgt von der Antigen-Antikörper-Reaktion.
(Proben)
Biotin-markierte λ-DNA wurde mit Photo-Biotin Labeling Kit (Nippon Gene Co., Ltd.) gemäß dem beigefügten Herstellungsprotokoll hergestellt, und dann wurden die Komponenten in 50 mM PBS (pH 7,5) mit Raten, wie in Tabelle 4 gezeigt, gemischt, um die Antigen-Antikörperreaktion auszuführen. Nachdem die Antigen-Antikörperreaktion erfolgt war, wurde das Medium mit 2,5 mM Carbonatpuffer (pH 10) unter Verwendung eines Ultrafiltrationsfilters, welcher ein „cutoff"-Molekulargewicht von 50000 aufwies, substituiert, um Proben zu erstellen.
Die Konzentration von 21 μg/ml fluorescein-markierter Antibiotin-Antikörper (Cosmo Bio Co. Ltd.) weist Molwerte an Biotin auf, äquivalent denen in 10 μg/ml biotin-markierter λ-DNA.
Tabelle 4
(Vorgänge)
Die elektrische Feldstärke betrug 1,07 MV/m und die Prozeduren wurden auf die gleiche Weise wie die in Beispiel 2 ausgeführt. Die Fluoreszenzmengen des fluorescein-markierten Antibiotinen-Antikörpers in den komplexen Molekülen und der freie fluorescein-markierte Antibiotine Antikörper wurden gemessen, um die Einfangrate zu bestimmen.
(Resultate)
Die Resultate sind in 17 gezeigt. Wie aus den Resultaten in 17 hervorgeht, ist es klar, dass die Einfangrate von dem komplexen Molekül 36% bei einer Biotin-λ-DNA-Konzentration von 10 μg/ml, 25% bei 5 μg/ml, 8,9% bei 2,5 μg/ml, und 6% bei 0 μg/ml betrug, und demnach die Einfangrate durch geminderte Konzentrati onen von biotin-markierter λ-DNA gemindert wurde. Unter ausreichenden dielektrophoretischen Bedingungen zum Einfangen der λ-DNA zu 100%, betrug die Einfangrate 6%, wenn unmarkierte λ-DNA der Probe 1 zum Einsatz kam, während der Einsatz von markierten λ-DNAs der Proben 2, 3 und 4 eine signifikante höhere Einfangrate ergab. Deshalb ist es klar, dass die Trennung von komplexen Molekülen, welche aus der Antigen-Antikörper-Reaktion von fluorescein-markierten Antibiotinen-Antikörpern und biotin-markierter λ-DNA von freien fluorescein-markierten Antibiotin-Antikörpern resultieren, die nicht an biotin-markierte ë-DNA gebunden sind, mit etwas Konzentrationsabhängigkeit ausgeführt werden kann.
Nützlicher Effekt der Erfindung
Wie oben erwähnt, wurden gemäß dem ersten Verfahren der vorliegenden Erfindung zwei oder mehrere Arten von Molekülen, welche in einer Lösung gelöst wurden und bisher nicht getrennt werden konnten, zum ersten Mal durch dielektrophoretische Kräfte erfolgreich voneinander getrennt durch ein Verfahren, bei welchem eine komplexe Substanz gebildet wird, welche eine trennungsverbessernde Substanz enthält, und welches in der Vergangenheit nicht ausgeführt wurde. Demnach ist die vorliegende Erfindung eine äußert bahnbrechende Erfindung.
Zusätzlich ist das zweite Verfahren der vorliegenden Erfindung das erste Verfahren, bei welchem zwei oder mehrere Arten von Molekülen, welche in einer Lösung gelöst sind und bisher nicht getrennt werden konnten, erfolgreich voneinander getrennt wurden unter Verwendung von dielektrophoretischen Kräften unter einem starken elektrischen Feld, welches in der Vergangenheit nicht zum Einsatz gekommen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die betreffenden Moleküle rasch und leicht aus einer Lösung getrennt werden, in welcher zwei oder mehrere Arten von Molekülen gelöst sind, wie beispielsweise Moleküle mit biologischer Komponente, wie zum Beispiel DNAs und Proteine, welche bis jetzt durch dielektrophoretische Kräfte nicht getrennt werden konnten.

Claims

Verfahren zum Trennen einer komplexen Substanz eines "spezifischen Moleküls" in einer Probe und einer "Substanz, die fähig ist, dielektrophoretische Eigenschaften des spezifischen Moleküls", welches an dem "spezifischen Molekül" bindet, zu ändern von anderen Molekülen als dem "spezifischen Molekül" in der Probe, umfassend – Bilden der komplexen Substanz aus dem "spezifischen Molekül und der "Substanz, welche fähig ist, dielektrophoretische Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", gekennzeichnet durch die Schritte des – Unterwerfens der resultierenden Reaktionsmischung, enthaltend die komplexe Substanz einer Dielektrophorese unter Verwendung eines ungleichförmigen elektrischen Feldes, und – Trennens der komplexen Substanz von (den) anderen Molekülen als dem "spezifischen Molekül" durch dielektrophoretische Kräfte.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend die Schritte des – Messens des "spezifischen Moleküls" in der separierten komplexen Substanz oder eines anderen Moleküls als das "spezifische Molekül" in der Probe, und – Bestimmens der Menge einer Komponente in der Probe auf der Basis des Messergebnisses.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei jedes der Komponente und des "spezifischen Moleküls" ein "zu messendes Molekül" ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Probe, enthaltend das "spezifische Molekül" mit einem "spezifischen Molekül, welches mit einer markierenden Substanz markiert ist" und der "Substanz, welche fähig ist, dielektrophoretische Eigenschaften eines spezifischen Moleküls zu verändern", welches an dem "spezifischen Molekül" bindet, in Berührung ist, um eine markierte, komplexe Substanz aus dem "spezifischen Molekül, welches durch die markierende Substanz markiert ist" und der "Substanz, die fähig ist, dielektrophoretische Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", zu bilden, und umfassend die Schritte des – Unterwerfens der resultierenden Reaktionsmischung, enthaltend die markierte komplexe Substanz einer Dielektrophorese unter Verwendung eines ungleichförmigen elektrischen Feldes, – Separierens der markierten komplexen Substanz von dem "spezifischen Molekül, welches durch die markierende Substanz markiert ist", welches nicht in die Bildung der komplexen Substanz involviert ist, – Messens des "spezifischen Moleküls, welches durch die markierende Substanz markiert ist", in der separierten markierten komplexen Substanz oder des "spezifischen Moleküls, welches durch die markierende Substanz markiert ist", welches nicht in die Bildung der komplexen Substanz involviert ist, und – Bestimmens der Menge der Komponente in der Probe auf der Basis des Messergebnisses.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Probe, enthaltend das "spezifische Molekül", eine Probe ist, welche abgeleitet ist aus einem lebenden Organismus oder ein behandeltes Material der organismus-abgeleiteten Probe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die "Substanz, welche fähig ist, dielektrophoretische Eigenschaften des spezifischen Moleküls zu ändern", eine Substanz ist, welche dem "spezifischen Molekül" durch Binden des "spezifischen Moleküls" dielektrophoretische Eigenschaften verleihen kann auf der Basis, auf der das "spezifische Molekül" von anderen in der Probe enthaltenen Molekülen als dem "spezifischen Molekül" durch Dielektrophorese getrennt werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die "Substanz, welche an dem spezifischen Molekül bindet", eine Substanz ist, welche an dem spezifischen Molekül durch eine "Antigen"-"Antikörper"-Reaktion, eine "Zuckerketten"-"Lecithin"-Reaktion, eine Enzym-"Inhibitor"-Reaktion, eine "Protein"-"Peptidketten"-Reaktion, eine "Chromosom- oder Nukleotidketten"-"Nukleotidketten"-Reaktion bindet.