DE3329288A1

DE3329288A1 - Verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung einer neuen, als dynamische saeulen-fluessigkeitschromatographie bezeichneten chromatographietechnik

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Publication number: DE3329288A1
Application number: DE3329288A
Authority: DE
Inventors: Michael Prof. Cais; Moshe Dr. Haifa Shimoni
Original assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Current assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Priority date: 1982-08-15
Filing date: 1983-08-12
Publication date: 1984-02-16
Anticipated expiration: 2003-08-13
Also published as: IL66551A; FR2532055A1; SE8304349L; JPH0441304B2; AU568462B2; IL66551A0; ES524934A0; GB8321305D0; GB2125312A; US4510058A; ATA291983A; CA1214398A; FR2532055B1; DE3329288C2; BE897508A; IT1194356B; SE457606B; AT394454B; CH662062A5; IT8322354A0

Description

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Bes chreibung

Die Erfindung betrifft die in den Patentansprüchen angegebene neue Chromatographietechnik, im folgenden als dynamische Säulen-Flüssigkeitschromatographie (DCLC) bezeichnet, .:ur Trennung von zwei oder mehreren Komponenten, die in Lösung vorliegen, unter Verwendung eines Bewegtbett-Chromatographiesystems, und sie betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Mit Chromatographie werden bekanntlich eine Anzahl physikalischer Methoden bezeichnet, die in der Chemie» und üiuio<jie zur Trennung und Identifizierung von Gemischen chemischer Verbindungen dienen. Das Prinzip aller dieser Chromatographievarianten liegt darin begründet, ein Gemisch von chemischen Verbindungen wiederholten Extraktion mit einer Flüssigkeit oder der Adsorption an einer Feststoffob2rflache zu unterwerfen. Das Gemisch wird physikalisch über eine stationäre Phase (Bett oder Säule) bewegt, bei der 2.3 sich entweder um einen Feststoff oder um eine in den Porjn eines Feststoffs ("der sich in diesem Bett oder dieser Säule befindet) immobilisierte Flüssigkeit handelt. Die Trennung chemischer Verbindungen durch Chromatographie kann von einer oder mehreren der folgenden physikalisch-chemischen Kräfte Gebrauch machen in Abhängigkeit vom speziellen chromatographischen System:

(a) von Unterschieden in der Adsorption an das poröse Medium, dem sogenannten Sorbens,

(b) von Unterschieden zwischen den relativen Löslichkeiten einer das inerte Medium (die stationäre Phase) überziehenden Flüssigkeit und der als mobile Phase bezeichneten Flüssigkeit, die durch die poröse Säule perkoliert,

(c) von Unterschieden im Ionenaustausch mit dem Soroens, 5 und

(d) von Unterschieden in der MolckülgrÖße, wenn d i ·.* Lösunn ein Gel von sehr geringer Teilchengröße durchströmt..

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!· Chromatographie wird auch präparative Chromatographie genannt, wenn sie zur Isolierung einer Fraktion aus einem Gemisch dient zu deren Weiterverwendung für zum Beispiel Spektroskopie, Identifizierung, Synthese for Forschung

δ oder kommerzielle Zwecke.

Die Originalarbeit über Chromatographie basiert auf Unterschieden in der Adsorption an einem in eine Säule gepackten inerten Material. Die als VerteilungsChromatographie bekannte Trennung von Komponenten basiert auf den relativen Löslichkeiten in dem Lösungsmittel, das durch eine Säule geschickt wird. Die bei dieser Chromatographietechnik erhaltene Auflösung hängt vom pH-Wert und der Ionenstärke d'is Lösungsmittels (der mobilen Phase) und den relativen Loslichkeiten der Bestandteile in den beiden Phasen ab; die verschiedenen Materialien können mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert und die Flüssigkeitsfraktionen können in einer Reihe von Röhrchen gesammelt und anschließend mit Hilfe von chemischen oder physikalischen Methoden analysiert werden. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) und die PapierChromatographie basieren auf Unterschieden zwischen der relativen Adsorption einer Komponente an einem inerten Medium. Bei der TLC besteht die stationäre Phase aus einer dünnen Schicht einer fein verteilten Substanz, die auf ein Blatt oder einen Kunststoffträger oder auf eine Glasplatte aufgebracht ist. Sorbentien, die üblicherweise Verwendung finden und als gebrauchsfertige Platten gehandelt werden, sind zum Beispiel Aluminiumoxid, Kieselgel (Silicagel) und Cellulose. Bei der Papierchromatographie -ann sich die mobile Phase durch Kapillarkräfte nach oben (sogenannte aufsteigende Chromatographie) oder durch Schwerkraft nach unten (sogenannte absteigende Chromatographie) bewegen.

Die Ionenaustauschchromatographie macht von der Trennung von Molekülen aufgrund ihrer Ionenladung Gebrauch. Das Sorbens oder die stationäre Phase besteht aus einem Polymer mit kovalent gebundenen Ionen. In Kationenaustauscherharzen

sind die fest gebundenen Ionen negativ geladen und mit positiven Ionen, die durch elektrostatische Ladungen lose gebunden sind, assoziiert. Die zu trennenden positiv geladenen Substanzen aus einem Gemisch werden zuerst an das Sorbent adsorbiert unter Ersatz der in dem Harz vorliegenden Kationen. Die Lösung ist auf einen pH-Wert gepuffert, Jer die Bindung erleichtert, worauf mit dem gleichen Puffer eluiert wird zur Entfernung der nicht-gebundenen Fraktionen der Lösung. Ein Anionenaustauscher arbeitet in genau der- glei- ^q chen Weise, außer daß seine kovalent gebundenen lor. n entgegengesetzt geladen sind und dadurch die Anionen a s der Lösung anziehen.

Die auf Unterschieden in der Molekülgröße basierenc.2 Tren- ^g nung erfolgt in der Gelfiltration, die auch als Molekuiarsiebchromatographie bekannt ist. Diese Methode trennt Moleküle aufgrund ihrer Partikelgröße, wobei allerdings die Form des Moleküls die Filtration bis zu einem gewissen Grad beeinflußt. Die verwendeten Gele liegen in Form von Kügelchen vor, welche ein Netzwerk von Porenöffnungen aufweisen, in denen kleine Moleküle eingeschlossen werden können. Das weitgehende kommerzielle Interesse an Chromatographie im allgemeinen und an der präparativen Flüssigkeitschromatographie im besonderen äußert sich in der großen Zahl an Publikationen, die verschiedene mikrofeinteilige Säulenpackungen und fertig gepackte Säulen vorschlagen, die zu einer besseren Trennung führen sollen als die auf dieserr. Gebiet bekannten Adsorbentien.

Es wurden nun die Forschungsarbeiten auf die Entwicklung eines neuen Konzepts für die Chromatographie gerichtet, bei der bekannte Adsorbentien zur Anwendung gelangen, wobei jedoch die Trennung sehr schnell erfolgt und leichter als mit den bekannten Techniken durchführbar ist. Das n^ue Konzept der Chromatographie gemäß vorliegender Erfindung basiert auf dem Einsatz einer sogenannten dynamite:, mi S-'iulo, bei dem das Bett mit dem Adsorbens bewegt wird i :n '-ogensatz zu der konventionellen Chromatographietfichni ., bei der

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-8-das Adsorbentienmaterial stationär ist.

Dae Erfindung schafft somit ein Verfahren für einen neuen Typ von Chromatographietechnik, die als dynamische Säulen-FlussigkeitsChromatographie (DCLC) bezeichnet wird und zur Trennung von einer oder mehreren in Lösung befindlichen Verbindungen dient, wie dies in den Patentansprüchen angegeben ist.

Offensichtlich findet besonders häufig der Einsatz eines Feststoffadsorbens in Form einer Säule oder eines Betts als Adsorbentienzone Anwendung und in diesem Falle erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft im Vergleich zu üblichen Chromatograph!etechniken. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch große Genauigkeit aus und hat die folgenden Hauptvorteile gegenüber bekannten chromatographischen Verfahren:

(a) Im Gegensatz zum durch Schwerkraft bewirkten Elutionsmittelfluß, wie er in der konventionellen Chromatographie vorliegt, wird in der dynamischen Säulen-Flüssigkeitschromatographie im Adsorbentienbett ein gewisser innerer Druck ausgeübt, der zu einer besseren Auflösung bei der Trennung der Komponenten führt.

(b) Das Verfahren ist sehr schnell, was auch auf den inneren Druck zurückzuführen ist, der in dem System ausgeübt wird.

( ") Das Verfahren erfordert weniger Elutionsmittel als in der konventionellen Chromatographie.

(u) Das Vorliegen des inneren Drucks im dynamischen Chromatographiesystem ermöglicht den Einsatz eines Adsorbens mit kleinerer Partikelgröße als in der konventionellen Chromatographie, was eine höhere Empfindlichkeit zur Folge hat.

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Der Z¹UIn Einsatz gelangende Mehrweghahn ist sehr wichtig, wenn verschiedene aufeinanderfolgende Elutionsmitt'il in das Testrohr eingeführt und weiter durch das Adsorbent:.enbett zur Erzielung der gewünschten Fraktionierung geleitet werden müssen. Wird das Adsorbentienbett hauptsächlich zur Vorbehandlung einer Probe oder zur Entfernung von einer Verbindung verwendet, so ist der Einsatz eines derartigen Hahns nicht erforderlich und es kann ein einfaches, am Boden geschlossenes Testrohr, das zum Kolben paßt, verwendet werden. In diesem Fall muß das Elutionsmittel in das Testrohr eingebracht werden, bevor der Kolben nach unten geschoben wird. Offensichtlich ist jedoch selbst dann, wenn keine Fraktionierung erforderlich ist, ein Testrohr mit einem Hahn vorteilhafter anzuwenden im Hinblick auf das Waschen des Adsorbens und die Einführung des Slutionsmittels durch Ansaugung desselben durch den Hahn.

Das Abdichtelement gleitet längs den Innenwänden des Testrohrs, wobei es sich in einem guten Kontakt mit diesen Innenwänden befindet und ein bündiges Einpassen des Kolbens in das Testrohr sicherstellt. Das Abdichtelement besteht in der Regel aus Kautschuk oder einem anderen geeigneten Material in Form eines O-Rings mit einer Öffnungsweite, die zum Gleiten längs der Innenwände des Testrohrs geeignet ist. Besteht die erfindungsgemäße Vorrichtung aus Glas, so kann der Schliff der Außenwand des Kolbens in solcher Weise erfolgen, daß er den O-Ring ersetzen kann.

Das erfindungs gemäße Verfahren ist sehr flexibel u \d kann in einer großen Anzahl von Anwendungen mit verschi -denen Aus führ ungs formen zum Einsatz gelangen, was im Rah. ien des Konzepts der vorliegenden Erfindung liegt. Ein Problem, das in jeder Art von Chromatographie existiert, ist da.; gleichmäßige Aufbringen der Probe auf die Oberfläche des Adsorbensbetts. Wird die Probe direkt durch Schwerkraftfluß aufgebracht, so ist eine gleichmäßige Aufbringung reliitiv schwierig, da das Bett dazu tendiert, beim Einbringen dor Probe aufgewirbelt zu worden. Ks int daher besonder:; wirbt-iq,

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die Oberfläche zu schützen, zum Beispiel mit einem Stück von Rayon-Filterpapier. Ein Hersteller von Säulen (Pharmacia Fine Chemicals AB) stattet einige der Säulen mit einer speziellen,.Probeapplikator genannten Einrichtung aus, die zum Schutz der Bettoberfläche dient- Bei dieser Einrichtung ist ein dünnes Nylongewebe am Ende eines kurzen Stücks von Perspex-Rohrauskleidung innerhalb des Chromatographierohrs montiert. Eine derartige Einrichtung erhöht selbstverständlich die Ausstattungskosten und hat zusätzlich den Nachtoil, daß ihr Vorliegen einen Druck auf den Fluß der Probe ausübt und deren Perkulation durch die Säule verlangsamt. In den meisten Chromatographiesystemen, in denen das erfindungsgemäße Verfahren zur Anwendung gelangt, ist das Problem einer gleichförmigen Aufbringung der Probe stark erleichtert.

Eei dem im chromatigraphischen Bett existierenden dynamischen Fluß wird die Flüssigkeit beim Einschieben des Kolbens in das Testrohr nach oben gedrückt und es besteht keine Tendenz zur Wirbelbildung aufgrund der Einführung der Probe. Außerdem beschleunigt der in dem System beim Einschieben des Kolbens in das Testrohr ausgeübte Druck die Fließgeschwindigkeit der Probe. Ein weiterer Weg zur Unterstützung einer gleichmäßigen Aufbringung der Probe besteht darin, oberhalb des Betts ein anderes geeignetes Adsorbens, das von dem im Bett bereits vorliegenden Adsorbens verschieden ist, anzuordnen, das die Aufgabe hat, eine Vorkonzentration der Probe zu bewirken und damit eine enge Bandauflösung zu fördern: Ein typisches Beispiel für ein derartiges geeignetes Adsorbens ist rohes Siliciumdioxid, das sich vom a :tiven Siliciumdioxid mit dessen hohen Adsorptionseigens :haften unterscheidet.

D.e Partikelgröße und die Teilchengrößenverteilung muß in den meisten üblichen Chromatographieoperationen sorgfältig gesteuert werden. Ein aus kleinen Partikeln bestehendes Bett ergibt in der Regel eine gute Auflösung. Der Grund hierfür ist darin zu sehen, daß der zu einer Zonenverbreiterung führende Mechanismus bei der Zunahme der Partikelgröße verstärkt wird. Bei großen Partikeln dauert die

-πι Diffusion in die Partikel und aus diesen heraus eine längere Zeit. Das Fließdiägramm in einem Bett aus großen Partikeln ist schlechter und äußert sich in einer stärkeren Wiedervermischung. Andererseits ist der Widerstand gegenüber dem Flussigkeitsfluß in einem mit großen Partikeln gepackten Bett geringer und die maximal erzielbare Fließrate höher. In üblichen bekannten Chromatographieoperationen muß daher in bezug auf Partikelgröße ein Kompromiß gefunden werden, um unter den erforderlichen Fließbedingungen eine maximale Zonenauflösung zu erzielen. Demgegenüber ist in der erfindungsgemäßen DCLC-Chromatographietechnik ein Adsorbens mit kleiner Partikelgröße verwendbar ohne mit den Nachteilen, wie sie bei den bekannten Chromatographiemethoden auftreten, konfrontiert zu sein, da der geringe Druck, der im Innern

]_5 des Systems ausgeübt wird, den durch die kleine Teilchengröße der Partikel verursachten Widerstand gegenüber der Fließgeschwindigkeit überwindet. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher selbst für kritische Fraktionierungen eingesetzt werden, wo die Verwendung eines feineren Adsorbentienmaterials unumgänglich ist, um die gewünschte Auflösung zu erzielen.

In der DE-OS 31 2 6 92 6 ist ein Verfahren zur Durch:ührung von Massentransfer- und -trennoperationen unter Verwendung von selektiven Barrieren beschrieben, das mit Hilf·.? einer Vorrichtung, die ähnliche Komponenten wie gemäß vorliegender Erfindung aufweist, realisierbar ist. Wie dort angegeben, besteht diese Vorrichtung aus einem eine Membran aufweisenden Mischerseparator und einem Mischbehälter, in den der Mischerseparator eingeschoben wird. Am Mischerseparator sind Einrichtungen zur Ausbildung einer Lufttasche vorgesehen, um den auf die Membran ausgeübten Druck zu erniedrigen. Während des Betriebs des Mischerseparators wird eine vorbestimmte Menge an Luft in der Lufttasche eingeschlossen, die bei der Kompression als Polster oder Stoßdämpfer wirkt und einen Teil des Drucks aufnimmt, der aus dein Widerstand der Membran gegen die Strömung der Flüssigkeit resultiert. Bei der erfindungsgemäßen dynamischen

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Saulen-FlüssigkeitsChromatographie ist das Erfordernis nach einer derartigen Lufttasche weniger zwingend als im angegebenen obigen Fall. Für bestimmte Systeme, bei denen relativ hohe Drücke ausgeübt werden, spielt jedoch offensichtlich eine derartige Lufttasche eine wichtige Rolle, da die eingeschlossene Menge an Luft Flüssigkeit, welche im Zwischenraum zwischen den Innenwänden des Testrohrs und den Außenwänden des äußersten Endes des Kolbens hochgekrochen ist, in das Testrohr zurückdrückt. Die Menge an Luft, die durch eine derartige Einrichtung am Kolben eingeschlossen wird, hängt von zahlreichen Faktoren ab, zum Beispiel vom Typ der Sperrplatte oder Barriere, den Komponenten des zu trennenden Gemisches und den besonderen Bedingungen, die in dem speziellen Chromatographisystem auftreten. Ein besonderer Vorteil der Verwendung einer derartigen Lufttasche tritt dann zutage, wenn es erforderlich ist, völlig darauf zu verzichten, das Hochkriechen von E Lutionsmittel mit Hilfe eines am Boden des Kolbens angeordn.'ten, als Abdicht element wirkenden O-Rings zu verhindern.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf den verschiedensten Gebieten der Chromatographie mit Erfolg einsetzbar, zum Beispiel bei der Silicagel-Chromatographie, der Umkehrphasen-FlussigkeitsChromatographie, der Kapillarchromatographie, der AffinitätsChromatographie, der Chromato-Fokussierung, der AusSchlußChromatographie (die auch unter dem Namen Gelfiltration bekannt ist) und der Ionenaustauschchromatographie.

Bei der Silicagelchromatographie handelt es sich um eine der üblichsten Chromatographiemethoden. Silicagel (Kieselgel·) ist bei weitem das beste bekannte Adsorbens und dazu im Vergleich mit anderen Adsorptionsmaterialien auch noch relativ billig. Die mit Silicagel beim erfindungsgemäßen Verfahren erzielbaren Trennergebnisse sind praktisch die gleichen wie bei üblichen Techniken oder sogar noch besser als diese in bezug auf Trenngenauigkeit und Ausbeute an wiedergewonnener Substanz, wobei es sich aber dadurch

auszeichnet, daß es einfacher und bequemer ist, weil es schneller arbeitet und weniger Lösungsmittel erforde-rt. Als besonderer Vorteil kommt auch hinzu, daß die Säulen wiederverwendbar ist. Zusätzlich können auch noch Silicagelpartikel mit kleinerer Teilchengröße und dichtere Packungen Anwendung finden mit den daraus resultierenden " Vorteilen eines höheren Trenneffekts.

Die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie beruht darauf, daß deren stationäre Phase weniger polar ist als die mobile Phase. Der Hauptnachteil bei Einsatz von Silicagel beruht darauf, daß nur eine teilweise Wiedergewinnung der durch ein derartiges Bett strömenden Verbindungen gelingt. Im Hinblick auf die mit Hilfe der erfindungsgemäßen DCLC-Technik erzielbaren Vorteile kann die Umkehrphasen-rlüssicrkeitsChromatographie auch mit Erfolg in der präparativen Chromatographie eingesetzt werden. In jüngster Zeit stieg auch das Interesse an der Kapillarchromatographie, insbesondere im Hinblick auf die Entwicklung von Mikrosäuler für Hochleistungs-Flüssigchromatographie. Der Grund für diese Entwicklungen liegt in den folgenden Vorteilen dieses Typs von Chromatographie:

(a) Die potentielle Erzielbarkeit einer größeren Trenneffizienz für komplexe Gemische und schwer in Lösung zu bringende gelöste Stoffe.

(b) Eine wesentliche Erniedrigung des Verbrauchs an Elutionsmittel.

Das erfindungsgemäße DCLC-Verfahren ist für Kapillarchromatographie leichter einsetzbar, wenn in dem zur Anwendung gelangenden Kolben ein enger Kanal vorgesehen wird.

Die Gelfiltration, die auch als Ausschlußchromatographie bekannt ist, gewinnt mehr und mehr Interesse bei der Reinigung von biologischen Substanzen unter Verwendung ' ines entsprechenden Adsorbens als Trennmedium. Gute Erc· -bnisse wurden bei der Trennung von markiertem Jod-hCG von markiertem Jod unter Verwendung eines Adsorbens vnm Sephudex G-Typ

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L (fiandelsprodukt der Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) mit I Life der erfindungsgemäßen dynamischen Chromatographietechnik (vergleiche das unten angegebene Beispiel 3) erhalten. Die Gelfiltration hat sich auch als einfache und rasche Methode zur Entsalzung oder zur Änderung von Puffer erwiesen. Das Ge !bett wird zweckmäßigerweise vor der Versuchsdurchführung mi'- einer Lösung mit der gewünschten Ionenzusammensetzung ins Gleichgewicht gesetzt, zum Beispiel mit destilliertem Wasser im Fall der Entsalzung. Die Elution wird mit der gleichen Flüssigkeit durchgeführt. Im Hinblick auf die dabei auftretenden hohen Fließraten kann die gesamte Operation in kurzer Zeit beendet und das entsalzte Material innerhalb weniger Minuten gesammelt werden. Andere Anwendungsgebiete für _mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführte Gelfiltration sind die Vorbehandlung vor einer HPLC-Operation und die Konzentrierung verdünnter Proben mi anschließender Trennung.

Di Chromato-Fokussierung findet weite Verbreitung zur Trennu: g von Proteinen aufgrund ihres isoelektrischen Punktes. Da die Chromato-Fokussierung zu extrem engen Banden an getrenntem Material führt und in der Regel lange enge Säulen erfordert, ist offensichtlich, daß die erfindungsgemäße dynamische Säulen-Flüssigkeitschromatographie für diesen Typ von Chromatographie ideal ist, wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem engen Kolben ausgestattet wird.

. Die erfindungsgemäße DCLC erweist sich auch als bequem und zweckmäßig für Ionenaustauschchromatographie, bei der es si :h bekanntlich um eine der weitverbreitesten Trenntechnike ι handelt. Es wurden verschiedene Versuche zur Trennung ve:i Kupfersulfat und Natriumbichromat an Dowec 5 0 WX 8 al. Adsorbens durchgeführt (vergleiche das unten angegebene Beispiel 2), wobei sich zeigte, daß mit Hilfe des erfindur.gsgemäßen Verfahrens wesentliche Vorteile in bezug auf Zeitersparnis, Lösungsmittelvolumen und Einfachheit der Durchführung erzielbar sind.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen DCLC-Technik liegt in der wesentlichen Verminderung des Totvolumens. Das Totvolumen wird bekanntlich als das Volumen an Flüssigkeit in den Zwischenräumen zwischen den Körnern des Adsorbens im Chromatographiebett definiert. In den meisten üblichen Chromatographieoperationen stellt das Totvolumen ein Problem dar, das die Erzielung eines genauen Ergebnisses wesentlich beeinflußt. Demgegenüber wird boi der erfindungsgemäßen DCLC aufgrund der Möglichkeit einer dichten Packung die

2Q Gleichgewichtsverteilung der Substanz zwischen dem Adsorbens und der Flüssigkeit sehr rasch mit sehr geringem Totvolumen eingestellt. Demzufolge ist es auch möglich, scharfe und enge Zonen zu erhalten. Dies ist sehr wichtig bei Fraktionierungen, bei denen der Unterschied im Elutionsvolumen

•]c zwischen den Substanzen im allgemeinen klein sind. Insbesondere bei der Gelfiltration verschlechtern große Totvolumen die erhaltene Auflösung.

Gemäß einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung wird das Adsorbens in einer Hülse angewandt, die in den Längskanal des Kolbens eingesetzt wird. Auf diese Weise j st die Chromatographievorrichtungen für zahlreiche Verwendungszwecke gebrauchsfertig durch einfachen Ersatz der Hülse durch eine andere, die das geeignete Adsorbens enthält (vergleiche die beigefügte Figur 5). Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch große Einfachheit aus und seine Vielseitigkeit neben den verschiedenen anderen Vorteilen wurde bereits erwähnt. Es gibt zahlreiche Ausführungsformen, die für die zur Durchführung des erfindungs- QQ gemäßen Verfahrens dienende Vorrichtung in Frage kommen.

Einige dieser Ausführungsformen werden im folgenden anhand der beigefügten Figuren 1 bis 9, welche die Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken, veranschaulicht.

Gemäß Figur 1 ist das Testrohr R mit einem Luor-V<-rschluß L ausgestattet, an dem ein Dreiweghahn LV angebracht i:5t. Das gewünschte Elutionsmittel E wird in das Testrohr R gedrückt. Der Kolben C hat einen Längskanal, in f.em das

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Adsorbens P untergebracht und zwischen zwei am Kopf und Boden des Kolbens befindlichen Membranen F₁, F„ gehalten wird. Oberhalb der oberen Membran F₂ ist ein Stopfen S vorgesehen mit einer Ausströmöffnung D, durch welche die getrennte Fraktion vom Adsorbensbett gesammelt wird. Am unteren Teil des Kolbens befindet sich ein O-Ring 0, der a.s Abdichtung dient und so ausgestaltet ist, daß er längs der Innenwände des Testrohrs R gleitet.

In der Ausführungsform gemäß Figur 2 ist am Boden des Testrohrs R kein Mehrweghahn vorgesehen und eine begrenzte Menge an gewähltem Elutionsmittel E wird zu Beginn in das Testrohr R eingefüllt. Der Kolben C besitzt den Längskanal, in dem das Adsorbens P untergebracht und zwischen den beiden Membranen F., F2 gehalten wird. Oberhalb der oberen Membran F2 befindet sich ein Stopfen S. Die Ausströmöffnung D, durch welche die getrennte Fraktion aus dem Adsorbensbett gesammelt wird, ist mit dem Kolben C verbunden. Am unteren Teil des Kolbens befindet sich der O-Ring 0 als Abdichtelement. Diese Vorrichtung bietet sich an, wenn keine Fraktionierung erforderlich ist und die Operation nur aus einem Zyklus mit einem einzigen Elutionsmittel besteht.

Gemäß Figur 3 ist das Testrohr R genau so wie in Figur 2 ohne am Boden angebrachten Hahn. Der Kolben C weist den Längskanal auf, in den das Adsorbens P eingebracht und zwischen den beiden Membranen F₁, F₂ gehalten wird. Oberhalb der oberen Membran F₂ ist ein Stopfen S vorgesehen mit einer Ausströmöffnung D, durch welche die getrennte· Fraktion aus dem Adsorbensbett gesammelt wird. Am Boden des Kolbens befindet sich der O-Ring O als Abdichtelement.

In Figur 4 wird die einfachste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung veranschaulicht, die ebenfalls am <ib Boden des Testrohrs R keinen Hahn aufweist und außerdem am Kopfende des Kolbens keinen Stopfen hat. Eine begrenzte Menge des gewählten Elutionsmittels E wird zu Beginn in das Testrohr R eingeführt. Der Kolben C besitzt einen

Längskanal, in dem sich das Adsorbens P befindet, das zwischen den beiden Sperrplatten oder Barrieren F₁, F₂, bei denen es sich um Membranen oder Filter handelt, gehalten wird. Der O-Ring 0 ist am unteren Teil de- Kolbens /orgesehen und dient als Abdichtung, wobei e in solcr Br Weise ausgestaltet ist, daß er längs d3r Innenwände des T istrohrs R gleitet. Mit dem das Adsorbens P aufnehmenden Kanal ist eine Ausströmeinrichtung D verbunden, durch welche die getrennte Fraktion gesammelt wird.

Figur 5 veranschaulicht eine Ausfuhrungsform, bei der eine Hülse CA, in der sich das gewünschte Adsorbens P befindet, in den Längskanal I des Kolbens C eingeführt wird. Das Sammeln des Elutionsmittels und der getrennten Fraktionen er-

-,c folgt durch eine Ausströmeinrichtung, wie sie im Zusammenhang mit den vorstehenden Figuren beschrieben ist. Der zur Abdichtung dienende O-Ring 0 ist am unteren Teil des Kolbens C vorgesehen. Die Anwendungs- und Wirkungsweise ist sehr einfach, wie im folgenden auch unter Hinweis auf Figur 1 erläutert werden soll. Der Kolben C wird nach unten in dar Testrohr R geschoben, das mit dem gewählten Elutionsmittel E gefüllt ist. Dies führt dazu, daß das Elutionsmittel durch die untere Membran F. und danach durch das Adsorbens P gedrückt wird, das sich im Längskanal des Kolbens C befindet, worauf es schließlich durch die Ausströmeinrichtung D (vergleiche hierzu Figur 4) heraustropft. Bei Füllung mit einem geeigneten Trägermaterial P wirkt die veranschaulichte Vorrichtung als Chromatograph!esauIe. Das Nachfüllen des Testrohrs R wird gemäß der in Figur 1 gezeigten Ausfüh-

gO rungsform einfach dadurch bewirkt, daß der Ausfluß des Testrohrs geöffnet und mehr Elutionsmittel durch den Hahn LV gepreßt wird.

Figur 6 veranschaulicht eine Ausführungsform der i-rfindungsgemäßen dynamischen Säulenvorrichtung, bei. der cIgl Säulenkolben C nach oben bewegt wird in das Testrohr R und der Ausfluß des Elutionsmittels durch einen vnrtikalen engen Kanal X in direkter Verlängerung des —*

säulenchromatographischen Trägermaterials erfolgt. Figur 7 stellt eine Modifikation der in Figur 6 gezeigten Säule dar, wobei ein Lösungsmittel-Vorratsbehälter in Form einer Säule über Y mit der dynamischen Säule verbunden ist.

Aus Figur 8 ist eine Ausführungsform ersichtlich, bei der der Kolben C der dynamischen Säule aus zwei oder mehr Untereinheiten besteht, von denen jede gleiche oder unterschiedliche Adsorbentien P enthält, wobei es möglich ist, das aus IQ jeder Untereinheit austretende Elutionsmittel zu sammeln.

Figur 9 veranschaulicht eine weitere Ausführungsform, aus der sich die Vielseitigkeit der erfindungsgemäßen DCLC ergibt, deren Anwendungsmöglichkeiten dadurch noch nicht erschöpft sind. Im Fall der dargestellten Ausführungsform . wird das austretende Elutionsmittel in eine andere Säule geleitet, welche das gleiche oder ein'unterschiedliches Adsorbens P enthält.

Die Figuren 10 bis 12 zeigen die grafische Auswertung von Versuchsergebnissen, die bei der Trennung verschiedener Gemische, wie sie in den unten angegebenen Beispielen 4,. 5 und 6 beschrieben werden, erhalten wurden.

Figur 13 stellt ein Diagramm dar, das bei der grafischen Auswertung einer ÄffinitätsChromatographie zur IgG-Isolierung erhalten wurde, wie dies im unten angegebenen Beispiel 9 beschrieben ist.

Im Prinzip kann die erfindungsgemäße dynamische Chromatographie auch für einen Einsatz in der Flüssig-Ionenaustauschchromatographie ins Auge gefaßt werden. Flüssige Ionenaustauscher werden als Flüssig-Flüssig-Extraktionssysteme definiert, deren Wirkungsweise, zumindest formell, auf dem Austausch von Ionen an der Grenzfläche zwischen einer wäßrigen Lösung und einem nicht-mischbaren Lösungsmittel mit vcrnachlässigbarer Verteilung des Extraktanten in die wäßrige Phase besteht. Flüssige Anionenaustauseher finden in

der Umkehrphasen-Extraktions Chromatographie Anwendung. Bei dieser Technik dient das mit dem flüssigen Anionenaustauscher imprägnierte Trägermaterial (Silicagel, Cellulosepulver, und dergleichen) als die stationäre Phase und eine wäßrige Lösung einer Säure oder eines ihrer Salze v,ird als Elutionsmittel (mobile Phase) verwendet. Zur Durchfährung des erfindungsgemäßen Verfahrens sollte die Membran so gewählt werden, daß sie nur für das Elutionsmittel, nicht jedoch für den flüssigen Ionenaustauscher permeabel ist, der in dem Längskanal des Kolbens verbleiben sollte.

Die zur Durchführung der DCLC verwendbare erfindungsgemäße Vorrichtung kann aus beliebigem inerten Material hergestellt sein, zum Beispiel aus Glas, Polyethylen oder einem anderen geeigneten Kunststoffmaterial und selbst Metall kommt für einige Spezialzwecke in Frage.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
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Beispiel 1

Trennung eines Gemisches aus Ferrocen und Ferrocenaldehyd

(a) Packmethode

1,0 g Siliziumdioxid (Merk, Kieselgel H, Typ 60) wurde in 5 ml einer entgasten Lösung von Dichlormethan/Hexan 1 : 1 im verschlossenen Testrohr dispergiert zur Herstellung einer Aufschlämmung. Der mit dem Stopfen und der oberen Membran ausgestatteten Kolben wurde in das Testrohr erngesetzt

bis ein fester Kontakt zwischen dem O-Ring und der Testrohr erreicht war.

Die gesamte Einheit wurde umgedreht, so daß sie se .krecht auf dem Stopfen stand und die Luft wurde durch den Auslaß im Testrohr entfernt. Der Testrohrauslaß wurde sod> nn verschlossen und ilns Packen orfolcfte in der Wni.«;**, da¹ »las Test.rühr eilLidruJ dam tt-til bt-tiluillUtm l^!,niLuli Jwn h nut <·ιι \itz-tjt-.>]i

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1. wurde mit einer Fließrate von 1 ml/min. Sobald das SiliEiumdioxidbett vollständig abgesessen war, wurde der Testrohrauslaß geöffnet und das Testrohr vom Kolben entfernt. Die untere Membran wurde installiert und damit war die Säule fortig zur Aufbringung der Probe.

(L) Probenaufbringung

Ein Gemisch von Ferrocen und Ferrocenaldehyd wurde in 0,2 bis 0,4 ml Dichlormethan gelöst und die Lösung wurde auf die untere Membran der senkrecht stehenden Säule aufgebracht. Die Lösung drang durch die Membran und die Komponenten wurden am Siliziumdioxid adsorbiert. Diese Prozedur konnte dadurch beschleunigt werden, daß mit Hilfe des geschlossenen Testrohrs etwas Luftdruck ausgeübt wurde.

(c) Elution

Der gepackte Kolben wurde in das 5 ml des gewählten Elutionsmittels enthaltende Testrohr eingesetzt. Luft wurde entfernt wie während des Packens der Säule und die Elution wurde durch Niederdrücken des Kolbens in das gefüllte Testrohr mit einer Fließrate von etwa 1 ml/min bewirkt.

Die mit zwei verschiedenen Gemischen erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

1) Trennung einer Testmischung aus Ferrocen (13 mg) und Ferrocenaldehyd (19 mg)

30 Frakt. Elutions-Nr. mittel-

volumen (ml)

Elutions- Gewicht Charaktemittel des Rück- risierung stands(mg)

0 1 2 3 4

7 8 9

Hexan	0	leer
Il	11,4	Ferrocen
Il	0,79	Ferrocen
11	0,31	Ferrocen
Dichlor	Spuren	leer
methan
M	1,79	Aldehyd
	IJ, -Ib	Aldehyd
	4,59	Aldehyd
Il	1 ,69	Aldehyd
• 1	Spuren	leer

2) Trennung einer Testmischung aus Ferrocen (25,3 mg) und Ferrocenaldehyd (15,6 mg)

Frakt.	Elutions-	Elutions-	Gewicht des	Charakte :i-
Nr.	mittelvo-	mittel	Rückstands	sierung
	lumen (ml)		(mg)
0	1	Hexan	0,2	Ferrocen
1	1	Il	19,0	Ferrocen
2	1	Il	1 ,7	Ferrocen
3	1	Il	0,3	Ferroce-n
4	1	"	0	leer
5	1	Dichlor-	0	leer
		methan
6	1	Il	0,2	Aid ehyd
7	1	U	11 ,5	Aldehyd
8	1	Il	2,9	Aid ehyd
9	1	··	0,7	Aldehyd
10	1	Il	0	leer

Beispiel 2

Trennung von Na₇Cr₉O₇ .2H„O von CuSO₄.5H₂O durch Ionenaustausch

Das Adsorbens bestand aus Dowex 50 WX8 (200 bis 400 mesh, entsprechend 0,038-0,074 mm lichte Maschenweite). Das Adsorbens wurde zuerst gewaschen und danach etwa 30 Minuten lang in destilliertem Wasser, das mit Salzsäure (2N) angesäuert war, stehengelassen. Die Azidität wurde sodann entfernt durch Waschen mit destilliertem Wasser und das neutrale Adsorbens wurde in den Längskanal des Kolbens eingeführt. Die beiden Membranen, welche das Adsorbens bett hielten, bestanden aus zwei Scheiben aus porösem PcIyethylenfilter.

Die in Form einer wäßrigen Lösung vorliegende Probe bestand aus 359,3 mg Na₉Cr₃O₇^H₉O und 369,7 mg CuSO₄-SH₀O, gelöst in 1 ml Wasser. Die Probe wurde durch dm; Artr.arb'-nr, qnlr-itet und die für Analysezwecke entnommene¹ Monq·..! an !'robe betrug 100 μΐ. Die Ionen wurden von der KäuLcj qowa:;chen und wie folgt getrennt:

BAD ORIGINAL

ciLe An ionen durch destilliertes Wasser; dia Kationen durch eine saure Lösung, bestehend aus 2 N-SaIzsäure.

Die Fraktionsanteile wurden in Reagens glas er η gesammelt. Dia Beendigung des Waschens wurde nach der Farbe der austretenden Lösung bestimmt. Die Proben wurden ferner quantitativ analysiert, indem die Fraktionsanteile bei 110 ⁰C getrocknet und der trockene Rückstand gewogen wurden. Eine Blindprobe für den Rückstand wurde durchgeführt, indem 100 μΐ der Probe in ein Teströhrchen eingeführt und bei 110 ⁰C getrocknet wurden. Der Feststoffrückstand wog 68,5 mg.

Die Ergebnisse, die beim Wiegen der verschiedenen getrockneten Fraktionen erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle II wiedergegeben. Im Versuch 2 wurde die Säule nach Durchführung des Versuchs 1 bis zur Neutralität gewaschen und neutralisiert.

Tabelle II

Trennung durch Ionenaustausch mit dynamischer Chromatographie

Versuch Nr. der Elutions- Gewicht der Gesamt- Bemer-Nr. Fraktion mittel trockenen gewicht kungen Fraktion (mg) (mg)

1	ELO	43,0	43,2	*)
2	Il ^	0,2
3	Il	0
4	HCl (2N)	0,5
5	Il	15,2	47,7	*)
6	If	27,5
7 8	Il Il	3,2 1,3
1	H₀O	44,2	45,3	*)
2	(I ^	1 ,1
3	Il	0,1
4	HCl (2N)	0,4
5	■■	2,3
6	Il	34,0	43,2	*)
7	Il	5,7	BAD	ORIGINAL
8	Il	0,8

*) farblose Fraktion

Die Ergebnisse zeigen, daß nach Durchlaufen von acht Fraktionen durch das Adsorbens praktisch die Gesamtmenge der Verbindungen entfernt und getrennt waren.

Um die Effizienz der erfindungsgemäßen DCLC zu zeigen, wurde ein Vergleichsversuch durchgeführt unter Verwendung einer üblichen Chromatographietechnik durch Elutionsmittel- Q fluß mittels Schwerkraft? wobei dxe gleiche Menge einer 100 μΙ-Probe und das gleiche Adsorbens eingesetzt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tab ille III aufgeführt.

Tabelle III

Trennung durch Ionenaustausch mit üblicher bekannter Chromatographiesäule

Nr. der	Elutions-	Gewicht der	Gesamt	Bemerkungen
Fraktion	mittel	trockenen	gewicht
		Fraktion (mg)	(mg)
1	H₉O	0,8
2	Il ^	50,3
3	Il	1,3
4	Il	0,5
5	"	0,2
6	Il	0,3
7	Il	0,4
8	Il	0,1
9	■ 1	0,3
10	Il	0,4
11	Il	0,1
12	Il	0,3
13	11	0,1	54,9	*)
14	HCl(2N)	0,0
15	Il	2,3
16	Il	23,0
17	Il	12,7
CX)	"	3,3
19		1 ,4
20		1,4	44,1	*)

*) farblose Fraktion

BAD

Die Ergebnisse zeigen, daß in diesem Falle zwanzig Fraktionen zur Trennung erforderlich sind gegenüber acht beim erfindungsgemäßen Verfahren.

Bc ispiel

Es wurde eine Lösung von 100 μΐ ß-hCG mit einem Gehalt an 30 bis 35 % markiertem Jod (*J~) mit Hilfe der erfindungsgemäßen DCLC unter Verwendung eines Sephadex G-10-Adsorbens getrennt. Die Elution wurde mit 10 ml Puffer bei einem pH-Wert von etwa 8 durchgeführt. Jede Fraktion bestand aus etwa 0,4 ml. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV-Trennung von *J„ enthaltendem ß-hCG auf Sephadex G-10

Fraktion Nr.	leer	cpm gemessen	gesamt
1	29,0	0
2	9348,0	957 8,0
3	1946,0	1962,8
4	292,0	267,7
5	130,0	10 4,8
6	114,0	84,5
7	108,0	82,0
8	78,0	48,2	12125 cpm
9	79,0	49,6
10	98,0	67,7
1 1	134,0	102,9
12	182,0	. 15.2,5
13	414,0	389,3
14	485,0	464,4
15	766,0	757,5
16	85 4,0	834,7
17	635,0	615,5
18	45 0,0	42 4,6
19	504,0	486,4
20	378,0	348,5
21	284,0	256,8
22	158,0	127,7
23	131 ,0	99,8	5169 cpm
gesamt	20534,0	205 94,4	17294

------- "-■■■■" "-"*·■ 3329238

Die Ergebnisse zeigen, daß die Ausbeute etwa 85 % beträgt. Bei Durchführung dieser Trennung mit Hilfe einer üblichen Chromatographietechnik wird weitaus mehr Elutionsmittel gebraucht und die Trennoperation dauert sehr viel länger.

Beispiel 4

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen DCLC-Verfahrens wurde eine Lösung eines Farbstoffgemischs bestehend aus 35 % Ceres red 7B, 28 % Nitro fast blue 2B, 25 % Nitro fast violet FBL und 12 % Ceres yellow R (alle Angaben in Vol.-%) getrennt. Dieses Farbstoffgemisch wurde von der Firma Merck bezogen (Katalognummer 935 4).

Eine Menge von 30 μΐ des Farbstoffgemisches in Dichlormethan wurde auf eine DCLC-Säule aufgebracht, die ein Adsorbens auf Siliziumdioxidbasis mit einer Partikelgröße von 15 bis 25 \im (Handelsprodukt Lichroprep Si-60 der Firma Merck, Katalognummer 9336) enthielt. Die Säulendimensionen waren wie folgt: Länge 10,6 cm und innerer Durchmesser 10 mm. Die Fließrate betrug 2 ml/min und als Elutionsmittel diente Dichlormethan.

Die Ergebnisse der Trennung sind in Figur 10 in grafischer Auswertung, gemessen als optische Dichte (O.D.) bei 25 4 nm gegen die Fraktionen, wiedergegeben. Wie aus den Kurven ersichtlich ist, wird eine rasche und saubere Trennung errei cht.

Beispiel 5

Es wurde ein Gemisch von polycyclischen Aromaten bestehend aus 50 % Benzol, 30 % Naphthalin und 2 0 % Anthracen (Angaben in Vol.-%) in n-Heptan-Lösung mit Hilfe des erfindungsgemäßen DCLC-Verfahrens getrennt.

Die aufgebrachte Probe bestand aus 5 0 ul und es wurde eine Säule mit den gleichen Ausmaßen wie in Β'¹! spiel 4, die da:;

BAD ORIGINAL

gl äche Adsorbens enthielt, eingesetzt. Die Fließrate betrug 2 il/min und das Volumen jeder Fraktion war 1 ml. Als EIuti »nsmittel diente n-Heptan.

Di ! Ergebnisse der Trennung sind in Figur 11 grafisch ausgewertet als optische Dichte (O.D.) bei 254 nm gegen die Fraktionen. Wie die Kurven zeigen, wurden die Komponenten in drei scharfe Peaks getrennt.

Beispiel 6

Es wurde ein Gemisch von Alkylphthalaten mit Hilfe des erfindungsgemäßen DGLC-Verfahrens unter Verwendung einer Säule wie in Beispiel 4 mit dem gleichen Adsorbens getrennt.

Die Alkylphthalate bestanden aus einem Gemisch von Dibutylphthalat, Diethylphthalat und Dimethylphthalat in n-Heptan/ Ethylacetat (90/10 Vol.-Teile). Das Elutionsmittel war ein Gemisch aus n-Heptan/Ethylacetat (90/10 Vol.-Teile). Die Fließrate betrug 3 ml/min, das Volumen jeder Fraktion war 1 ml. Die Ergebnisse der Trennung sind in Figur 12 grafisch ausgewertet als optische Dichte (O.D.) bei 254 nm gegen die Fraktionen. Wie die Kurven zeigen, wurde eine klare Trennung erreicht.

Be Lspiel 7

Reinigung von Anti-hCG

Die Reinigung wurde mit Hilfe des erfindungsgemäßen DCLC-Verfahrens unter Verwendung zweier verschiedener Bezugsquellen dieser Verbindungen durchgeführt, nämlich a) von Serono und b) von Miles, wobei bekannt ist, daß das letztgenannte Produkt weniger konzentriert ist als das erstgenannte.

a) Reinigung von Anti-hCG (Serono)

Eine Phiole von Anti-hCG wurde rekonstituiert mit 1 ml

-27-

Phosphatpuffer (pH = 6,3). Die Lösung wurde auf eine Säule von 10,6 cm Länge und 10 mm innerem Durchmesser aufgebracht, welche 3 g Cellulose (Handelsprodukt DEAE DE-52 der Firma Whatman) als Adsorbens enthielt. Die Säule wurde mit Phosphatpuffer (pH = 6,3) eluiert mit einer Fließrate von 2,5 ml/min. In den ersten Fraktionen (4 bis 8) war sofort ein sehr hoher Peak von Proteinen sichtbar. Die Säule wurde an eine Fließzelle und einen Recorder zur sofortigen Bestimmung angeschlossen. Ein Pufferwechsel auf pH = 7,1 führte zu einem fast sofortigen Auftreten von Proteinen. Zwei weitere Hauptpeaks von Proteinen wurde eluiert.

Die Bestimmung erfolgte durch Messen der Adsorption bei 280 nm optische Dichte (O.D.) jeder Fraktion. Die inmunologische Aktivität in jeder Fraktion zum hCG-Nachweis erfolgte mit Hilfe der RIA-Methode unter Verwendung der fol-

1 25
genden Lösungen: 100 μΐ J- hCG; 100 μΐ Serum frei von hCG und 100 μΐ jeder Fraktion. Die Inkubation wurdo 3 h lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Trennung erfolgte unter Einsatz eines Polyethylenglykol/Doppelantikörpers (20/¹ Vol.-Teile).

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V aufgeführt.
25

-2 8-

Tabelle V Trennung von Anti-hCG Serono auf DEAE DE-52

Fraktion Nr.	O.D.	RIA % Bin dung	Fraktion Nr.	O.D.	RIA % Bin dung
1	0,004	0,1	16	0,013	19
2	0,002	0,1	17	0,039	16,4
3	0,004	14,1	18	0,03	5,0
4	0,006	2,1	19	0,012	3,0
5	0,63	22,8	20	0,019	6,4
6	0,87 9	12,3	21	0,044	10,3
7	0,097	2,8	22	0,029	4,5
8	0,01	0,1	23	0,018	4,0
9	0,008	0,1	24	0,015	3,0
10	0,003	0,1	25	0,008	2,6
11	-	0,1	26	0,002	2,4
12	0,002	0,1	27	0,002	0,1
13	0,002	0,1	28	0,01	0,1
14	0,003	0,1	29	-	0,1
15	0,01	0,1

Die Ergebnisse zeigen, daß drei Hauptpeaks erhalten wurden, wobei die immunologische Aktivität extrem hoch blieb im Vergleich zur Proteinkonzentration.

b) Reinigung von Anti-hCG (Miles) 70 μΐ Antikörper (als Kaninchenserum) wurden auf die DEAE DE-5 2-Säule aufgebracht (wie im Versuch (a) beschrieben) und zuerst mit Phosphatpuffer (pH = 6,3) eluiert. Wie im Versuch a) wurde ein rasch auftretender Proteinpeak eluiert in den Fraktionen 3 und 4. Durch Erniedrigung der optischen Dichte (O.D.) und Änderung des Puffers auf pH = 7,1 wurden drei weitere Hauptpeaks gesammelt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI aufgeführt.

Tabelle VI
5

Trennung von Anti-hCG Miles auf DEAE DE-52

10	Frak tion Nr.	O.D.	RIA % Bin dung	Protein A* % Bin dung	Frak tion Nr.	O.	D.	RIA % Bin dung	Protein % Bi n- duna	0	9
	1	0,01	0,1		21	0,	094	63,6	7,	2
	2	0,102	0,1	-	22	0,	042	64,3	7,
	3	0,65 6	64,2	2,6	23	0,	041	63,4	-
15	4	0,416	45,6	-	24	0,	07	1 ,0	-	9
	5	0,091	0,1	-	25	0,	51 8	60,3	5 ,	3
	6	0,055	0,1	-	26	0,	518	67,7	5,	5
	7	0,044	0,1	-	27	0,	299	55,5	4,	7
	8	0,022	0,1	- -	28	0,	161	58,4	3,	5
20	9	0,016	0,1	-	29	0,	120	66,0	2,	8
	10	0,007	0,1	-	30	0,	1 12	54	1 • ,	9
	11	0,005	0,1	-	31	0,	091	51 ,3	3,	4
	12	0,003	0,1	-	32	0,	07 4	59,7	2,	unbekannt
	13	0,003	0,1	-	33	0,	062	55,7	-
25	14	0,004	0,1	-	34	0,	062	60,9	1 ,
	15	0,001	0,1	-	35	0,	043	59,5
	16	0,004	0,1	-	36	0,	.034
	17	0,011	0,1	-	37	O₁	,035
	18	0,034	65,4	7,2	38	0,	,02 9
30	19	0,291	55,5	12,1	39	0,	,021
	20	0,247	61 ,4	11,6

Die Ergebnisse zeigen, daß das getrennte Anti-hCG in drei Hauptpeaks gesammelt wurde, die alle immunologisch·-:! Aktivität zeigten, Absorption bei 280 nm aufwiesen und i-inen Nachweis durch Protein Λ* ergaben. AlJu I'cak:; waren :.<·!...iri voneinander getrennt und wurden «jc?isainmc? It.

BAD ORIGINAL

I^ci i :-i f.'i c¹1 8

Trennung von Humanserum

Die Trennung mit Hilfe des DCLC-Verfahrens erfolgte nach einer Prozedur, die identisch ist mit derjenigen, wie in Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Md. Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, 1973, 2. Auflage) beschrieben,.

Die Chromatographie basiert auf Ionenaustausch auf einem Celluloseadsorbens und einer Gradientenelution mit Phosphatpuffer (0,02 M) von pH 5,7.

Die verwendete Säule hatte einen inneren Durchmesser von 10 mm und war gepackt mit 3 g DEAE DE-52 (HändeIsprodukt der Firma Whatman) und sie wurde gewaschen mit dem Phosphatpuffer 'pH = 8) mit einer Fließrate von 2,5 ml/min.

Der Gradient wurde mit einem Zweikammersystem erzeugt unter Verwendung von 40 ml Phosphatpuffer pH 8 und 60 ml Phosphatpuffer pH 5,7. 3 ml Humanserum wurden getrennt in Fraktionen von 1,5 ml, von denen jede gesammelt wurde, worauf der darin enthaltene Proteingehalt durch optische Dichte (O.D.) bei 280 nm gemessen wurde.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VII aufgeführt.

-31-

Tabelle VII

Trennung von Humanserum (O.D. bei 2 30 nm]

Frak	O.D.	Frak	O.D.	Frak	O.D.
tion		tion		tion
Nr.		Nr.		Nr.
1	0,0017	13	0,052	25	0,06
2	1,3	14	0,061	26	0,026
3	1,3	15	0,102	27	0,008
4	1,3	16		28	0,004
5	0,554	17	0,187	29	0,011
6	0,262	18	0,355	30	0,003
7	0,135	19	0,379	31	0,008
8	0,082	20	0,361	32	0,015
9	0,067	21	0,313	33	0,016
10	0,064	22	0,233	34	0,011
11	0,055	23	0,156	35	0 ,005
12	0,052	24	0,098	36	0,006

Die Ergebnisse zeigen, daß die Trennung nach dem traditionellen Kurvenbild von getrenntem Humanserum erfolgte mit zwei Hauptpeaks (IgG, Albumine). Die Trennung war in kurzer Zeit beendet.

Beispiel

Das erfindungsgemäße DCLC-Verfahren wurde auf Affinitätschromatographie angewandt zur Isolierung von Kaninchen-TgG unter Verwendung von Sepharose-4B (Handelsprodukt der Firma Pharmacia) -Antikörper (Antikörper = Ziegen-Antikaninchen)

als Ligand. 35

BAD ORJC

scpharose-4B-Antikörper:

10 DCLC-Säule Bestimmung:

Puffer:

-32-

Der Antikörper wurde an das aus Sepharose-4B (Handelsprodukt der Firma Pharmacia) bestehende Adsorbens gekuppelt unter Beachtung der Instruktionen, die von Axel Porath et al. in Nature 214, 1967, gegeben werden.

1 g Sepharose-4B

50 %

30 mg Ziegen-Antikaninchen) ^Bindun?

Glassäule von 6 mm innerem Durchmesser, gepackt mit Sepharose-4B-Antikörper

direkt von der Säule mit Fließzellen unter Messung der UV-Absorption bei 280 nm

1. Phosphatpuffer/NaCl, pH 7,8

2. Glycin/HCl (0,1 M), pH 2,5.

Die Verfahrensweise umfaßte folgende Stufen: 20 1. Kuppeln von Sepharose-4B an Ziegen-Antikaninchenserum

2. Packen einer DCLC-Säule mit Sepharose-4B-Antikörper 3 ml Gel, von beiden Seiten geschlossen mit einem Filtersystem VYON (Handelsprodukt) , etwa 40 μΐη.

3. Waschen der gepackten Säule mit 6 ml Puffer 1.

4. Laden der Säule mit 0/5 ml N.R.S. (Normalkaninchenserum)

5. Inkubation bei 37 ⁰C 2 h lang

6. Elution mit Puffer 1 und Sammeln der Fraktion, bis die optische Dichte am Photometer unter 0,1 beträgt.

7. Elution mit Puffer 2 von pH 2,5 und Sammeln der Fraktionen, bis die optische Dichte unter 0,1 beträgt.

Die grafische Auswertung der erhaltenen Ergebnisse dieser Affinitäts-Chromatographie ist in Figur 13 gezeigt.

Claims

Prof. Michael Cais, 4 Harofe St. Haifa, Israel Moshe Shimoni, 2. Victor Hugo St. Haifa, Israel Technion Research & Development Fundation Ltd., Technion City, Haifa 32 000, Israel Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung einer neuen, als dynamische Säulen-Flüssigkeitschromatographie bezeichneten Chromatographietechnik Patentansprüche

1. Verfahren für eine neue, als dynamische Säulen-Flüssigkeit sChromatographie bezeichnete Chromatographietechnik zur Trennung einer oder mehrerer in Lösung befindlicher Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein sich bewegendes Feststoffadsorbensbett mit einem Kolben, der an seinem Bodenteil mit einem Abdichtelement und in seinem Inneren mit einem Längskanal, der ein zwischen zwei als Barrieren dienenden Sperreinrichtungen gehaltenes Adsorbens enthält, versehen ist, sowie ein an seinem Boden gegebenenfalls mit einem Mehrweghahn versehenes Testrohr, in das der Kolben bündig paßt, einsetzt, den Kolben in das Testrohr schiebt unter Einführung und Transport des gewünschten, zuvor durch den Hahn gedrückten oder von oben in das Testrohr (eingefüllten Elutiom;-raittels durch den Kanal zur Fortbewegung der zn trennenden adsorbierten Verbindungen zwischen den Barrieren,

BAD ORIGINAL

.1 und die erhaltene Lösung durch eine am Kopfteil des Kolbens befindliche Ausströmeinrichtung abzieht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei geschlossener Stellung des Hahns die Flüssigkeit unter innerem Druck durch den Kanal führt zur Fortbewegung der zu trennenden adsorbierten Verbindungen zwischen den Sperrplatten.

-^q 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein zusätzliches geeignetes Adsorbens, . das von dem in der dynamischen Säulen-Flüssigkeitschromatographie verwendeten Adsorbens verschieden ist, einsetzt zur Vorkonzentrierung der eingebrachten Probe.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein am Boden geschlossenes Testrohr einsetzt und das Elutionsmittel in das Testrohr einbringt, bevor der Kolben nach unten in das Testrohr geschoben wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chromatographietechnik als SilicagolChromatographie, Umkehrphasen-Fli^ sinket t sch tomat Q-graphie, AffinitätsChromatographie, KapillarChromatographie, Chromato-Fokussierung^ Gelfiltration oder Ionenaus t aus chchromato graphie durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Feststoffadsorbens in eine Hülse einführt, die im Längskanal des Kolbens untergebracht wird,

7. Vorrichtung zur Durchführung der als dynamische Säulen-Flüssigkeitschromatographie bezeichneten Chromatographietechnik zur Trennung einer oder mehrerer in Lösung befindlicher Verbindungen, gekennzeichnet durch

- ein Testrohr (R) , das an seinem iSoden gegebenenfalls r.iit einem Mehrweghahn (LV) versehen ist,

- einen Kolben (C), der in das Testrohr bündig einpaßt Und an seinem Bodenteil ein Abdichtelement und in seinem Inneren einen Längskanal aufweist, der ein zwischen zwei als Barrieren dienenden Sperreinrichtungen (F-. , F„) gehaltenes Adsorbens (P) enthält, und

- eine Ausströmeinrichtung (D), die sich am Kopfonde des Kolbens (C) befindet.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß

die Ausströmöffnung für das Elutionsmittel als vertikaler enger Kanal in direkter Fortsetzung der Säule ausgebildet ist.

9. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß am Bodenteil des Kolbens ein Abdichtelement vorliegt, das zum Gleiten längs der Innenwände des Testrohrs ausgestattet ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß

das Abdichtelement aus einem inerten Material besteht.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Abdichtelement aus einem Kautschuk-O-Ring besteht, dessen Öffnungsinnenteil am Längskanal befestigt ist.

12. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Säulenkolben in Form von zwei )der mehreren Untereinheiten ausgestaltet ist, von d men jede das gleiche oder ein unterschiedliches Adsorbens enthält.

13. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 12, dadurch qokenn- [\f, ZfMPhnnl , fl-iß t] i π ΛπϋΊ I η'ίπιοΙ ί MiiM'i in ·Ι-·ι ■■! .·ΐι n "ι···ι '

—H₃ BAD ORIGINAL j

14. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein Stopfen am Kopfende des Kolbens vorgesehen ist.

15. vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausströmöffnung mit einem Kanal in Verbindung steht, der sich durch den Stopfen erstreckt.

16. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 15, dadurch

gekennzeichnet, daß ein als Säule ausgebildeter Lösungsmittel-Vorratsbehälter mit der Säule für die dynamische Chromatographietechnik verbunden ist.

17. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Testrohr an seinem Boden geschlossen ist.

18. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Kolben mit Einrichtungen zur Ausbildung einer Gastasche ausgestattet ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtungen zur Ausbildung einer Gastasche aus am Kolben befindlichen horizontalen, vertikalen oder spiralförmigen Vertiefungen bestehen.

20. Vorrichtung nach den Ansprüchen 7 bis 19, dadurch gekannzeichnet, daß sie aus einem inerten Material hergestellt ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 2O₇ dadurch gekennzeichnet, daß das inerte Material aus Metall, Glas, Polyethylen oder anderem entsprechenden Kunststoffmaterial besteht.